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小黑药亲电成分干预肝细胞脂肪变性的作用及机制研究

董文乐  
【摘要】:非酒精性脂肪肝(NAFLD)是代谢综合征在肝脏的首要表现,肝细胞脂肪变性是NAFLD的重要病理特征。NAFLD的发生与脂代谢紊乱、线粒体功能障碍及氧化应激等因素密切相关,参与调节相关因素的Nrf2-Keap1信号通路被认为是干预NAFLD的重要途径。以缺电子基团为结构特征的亲电成分可通过修饰Keap1的半胱氨酸巯基激活Nrf2-Keap1信号通路,是一类亟待开发的NAFLD干预因子。新资源食品小黑药是菊科旋覆花属显脉旋覆花(Inula nervosa Wall.)的根茎,含有潜在的亲电成分,但其亲电组分尚未明确,对NAFLD的干预作用尚未阐明。本研究采用GSH亲和磁珠(GSH-MNPs)靶向敲出技术及基于全球天然产物分子网络集群数据库(GNPS)的分子网络技术分析小黑药中的亲电成分,并基于游离脂肪酸(FFA)(油酸:棕榈酸=2:1)诱导的HepG2细胞模型研究小黑药亲电成分对肝细胞脂肪变性的作用及分子机制。首先,评价了亲电成分经GSH-MNPs敲出前后的小黑药醇提物对FFA诱导肝细胞脂质累积与ROS生成的影响。结果表明,在0.5~8.0mg/mL的浓度下,亲电成分敲出前后的小黑药醇提物均降低细胞脂质累积与ROS水平,亲电成分敲出后相应活性均出现下降,8.0mg/m L浓度下具有显著性差异(P0.05)。采用超高效液相串联质谱、GNPS分子网络技术、多维变量统计方法对亲电成分敲出前后的小黑药醇提物进行分析,结果表明敲出前后的成分存在差异,进一步发现了38个显著变化的成分(P0.05,FoldChange2),确定了13-OxoODE、9(10)-EpOME、10-Isobutyryloxy-8,9-epoxythymol isobutyrate(XHY-1)等3个亲电成分的化学结构,均为小黑药中首次发现的成分。其次,利用FITC荧光探针的方法表征了小黑药石油醚、乙酸乙酯、水部位中亲电成分的相对含量,结果表明小黑药亲电成分的分布为乙酸乙酯石油醚水。评价了亲电成分敲出前后的小黑药各极性部位干预肝细胞脂肪变性的作用,结果表明在0.5~2.0mg/mL的浓度下,敲出前后均可降低细胞脂质累积和ROS水平,亲电成分敲出后的活性下降,其中乙酸乙酯部位的活性下降最明显。进一步探究亲电成分敲出前后的小黑药乙酸乙酯部位对细胞脂代谢、氧化还原状态与线粒体功能的影响,结果表明,在0.5~2.0mg/mL的浓度下,敲出前后均可改善细胞脂代谢、氧化还原状态与线粒体功能,敲出后的相应活性下降,2.0mg/m L的浓度下具有显著性差异(P0.05),敲出成分对脂代谢水平的改善主要体现在PPARa表达上调,SREBP1c、FAS表达下调与TG含量的降低;氧化还原状态的改善主要体现在Nrf2及下游GCLC、NQO1、Gpx1的表达上调与抗氧化酶水平的提高;线粒体功能的改善主要体现在IDH3、ND1、ATP5A1表达的上调与乙酰辅酶A、NADH/NAD~+、ATP水平的提高。最后,采用柱色谱技术从乙酸乙酯部位中追踪分离、制备了XHY-1,并采用~1H-NMR表征了化学结构。基于FFA诱导肝细胞评价了XHY-1对细胞氧化还原状态、脂代谢、线粒体功能的影响,结果表明在1~10mM的浓度下,XHY-1可上调细胞内Nrf2及下游抗氧化基因的表达,提高抗氧化能力,上调PPARα、CPT1A的表达与下调SREBP1c、FAS、ACC1的表达,降低脂质累积水平,上调OGDH、ND1、ATP5A1的表达,提高乙酰辅酶A、NADH/NAD~+、线粒体膜电位与ATP水平,10mM下的活性最好。基于MOEdock的共价对接的分析结果表明,XHY-1的干预作用可能是通过与Keap1 Cys151上的巯基结合,上调Nrf2的信号通路实现的。综上所述,小黑药具有干预肝细胞脂肪变性的作用,亲电成分是其重要的活性成分,主要集中在乙酸乙酯部位。小黑药亲电成分,如XHY-1,可能通过与Keap1上重要的半胱氨酸巯基结合,上调Nrf2的表达,改善细胞氧化还原状态,进一步改善细胞脂代谢与线粒体功能,进而干预肝细胞脂肪变性,具有干预NAFLD的应用前景。


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