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啤酒污染细菌多样性分析及异α-酸抗性机制研究

郑飞云  
【摘要】:啤酒是是世界上最古老和产量最大的酒精饮料之一。由于啤酒酿造流程长,生产设备和环节多,仍然存在微生物污染的风险。啤酒污染细菌是可以存着与啤酒环境的细菌,对啤酒的生物稳定性有一定影响。对啤酒酿造过程污染细菌的有效监控是保障啤酒饮料生产安全和产品质量安全的必备环节,啤酒污染菌也是啤酒行业关注和研究的热点之一。在啤酒酿造过程中,酒花中的α-酸会发生异构化变为异α-酸。异α-酸是一种天然抑菌剂,可以抑制部分细菌在啤酒中的生长,同时少部分细菌能够适应这种异α-酸胁迫的微环境,对啤酒正常生产构成威胁。污染细菌通过长期适应性进化,获得了适应酒类饮料微环境的特殊能力,反映出共同的生理适应性特征。通过对啤酒生产过程中污染细菌的规律把握与生理特征分析,并进一步研究揭示啤酒污染细菌对异α-酸胁迫的适应性机制,为酿造过程中的污染细菌控制提供理论依据。论文主要结论如下:在啤酒生产旺季,长江中下游地区高温高湿的环境非常适合各类细菌的生长。本文以我国长三角地区7家啤酒厂为研究对象,从啤酒酿造设备、环境和酿造过程等环节中共分离得到205株啤酒污染细菌,通过M13-PCR指纹聚类分析和16S rDNA测序进行了鉴定,建立了我国长三角地区啤酒污染细菌菌株库。结果发现,这些污染细菌大多属于乳酸菌,主要为Lactobacillus属、Lactococcus属和Leuconostoc属;其中,植物乳杆菌、乳酸乳球菌、短乳杆菌和干酪乳杆菌数量较多,分别为39株、34株、33株和30株。进一步研究发现包装工段灌酒机等与酒液密切接触的环境及设备是污染细菌最主要的检出源。建立并优化了异α-酸梯度平板的定量分析方法,可以准确定量分析啤酒污染细菌的异α-酸最小抑制浓度。发现205株啤酒污染菌中绝大部分菌株(95.7%)均表现出一定程度的异α-酸抗性。与此同时,采用植菌实验和PCR方法测定和分析了菌株库中139株Lactobacillus属细菌的啤酒腐败能力及异α-酸抗性相关基因,并对Lactobacillus属细菌的异α-酸抗性能力、啤酒腐败能力与异α-酸抗性基因进行关联性分析。结果发现,具备异α-酸抗性能力是Lactobacillus属细菌具有啤酒腐败能力的前提条件;采用horA和horC基因分析判断菌株的异α-酸抗性能力和啤酒腐败能力均存在假阳性和假阴性的问题。2株具有较强异α-酸抗性能力的Lactobacillus属细菌的horA和horC基因均为阴性,说明在该菌株中可能存在新的异α-酸抗性机制。通过连续传代培养,以L.casei 2-9-5菌株为出发菌,得到异α-酸耐受能力明显弱于出发菌株的L.casei W2-9-5菌株,采用转录组学对L.casei 2-9-5和L.casei W2-9-5菌株在异α-酸胁迫下的基因表达水平进行分析,发现L.casei应对异α-酸胁迫表达显著上调的基因主要集中在细胞膜组成、跨膜运输、有机酸代谢、氨基酸代谢和氧化磷酸化过程。在所有基因中,发现属于ABC转运家族的mntA、mntB和mntC基因以及编码F_0/F_1-ATP合酶亚基的ATPa、ATPb、ATPc和ATPδ基因显著上调。将mntA、mntB和mntC基因在模式菌株L.lactis NZ3900菌株进行异源表达,并通过锰离子外源添加实验,发现维持胞内锰离子浓度对于乳杆菌耐受异α-酸具有重要影响;据推测mntA、mntB和mntC基因编码的二价金属离子转运蛋白可以通过抵消异α-酸带来的H~+/Mn~(2+)交换效应提升干酪乳杆菌的异α-酸耐受能力。通过基因异源表达以及菌株产ATP能力分析,发现ATP酶相关基因的过表达有助于菌株在异α-酸胁迫条件下生长;与弱异α-酸耐受能力的菌株相比,具有较强异α-酸耐受能力的干酪乳杆菌菌株产ATP能力较强。为了进一步研究污染菌在异α-酸胁迫下蛋白质表达水平的差异,了解异α-酸胁迫下的细胞应激反应,利用蛋白组学技术对啤酒污染菌L.casei 2-9-5在异α-酸胁迫条件下的蛋白表达情况进行分析,发现并成功鉴定了68个表达上调的蛋白质。上调蛋白质主要集中在碳水化合物转运及能量代谢、细胞膜/细胞壁组成和有机酸/氨基酸代谢途径。同时,发现大量上调蛋白质需要依赖二价金属离子,特别是Mn~(2+)对L.casei 2-9-5菌株的异α-酸耐受能力有重要影响。通过L.casei 2-9-5菌株胞内氨基酸和胞外有机酸含量测定以及外源氨基酸和有机酸添加实验,发现在异α-酸压力条件下菌株胞内氨基酸和胞外有机酸含量增加;外源添加氨基酸对L.casei 2-9-5菌株的异α-酸耐受能力的影响不大,但是外源有机酸(特别是丙酮酸、草酸、酒石酸和酮戊二酸)的添加有助于L.casei 2-9-5菌株在异α-酸胁迫下生长。进一步通过外源有机酸添加实验,发现有机酸,特别是丙酮酸、草酸、酒石酸和酮戊二酸,对具有不同啤酒腐败能力的不同种啤酒污染乳杆菌的异α-酸耐受能力均有促进作用,说明有机酸对提升L.casei异α-酸抗性具其具有普遍性。


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