青梅酒酿酒酵母的选育及耐酸机制解析

【摘要】：青梅(Prunus mume Sieb.Et Zucc)属于蔷薇科,主要在中国、日本和韩国等地种植,其富含多种有机酸、氨基酸、维生素、微量元素等营养成分以及花青素、萜烯和植物甾醇等功能成分。青梅酒是一种流行于亚洲地区的水果酒,目前仍以浸泡型为主。酿酒酵母对酒体风味物质代谢具有重要作用,但因青梅果酸度高和缺少专用的耐酸酿酒酵母,导致发酵型青梅酒的发酵时间较长、风味不足以及典型性特征不突出等问题,限制了发酵型青梅酒的工业化生产。因此,获得具有耐酸性的青梅酒专用酿酒酵母是提升青梅酒品质的关键。本论文首先采用常压室温等离子体(atmosphericand room temperature plasma,ARTP)诱变技术、高通量筛选(high-throughput screening,HTS)和适应性实验室进化(adaptive laboratory evolution,ALE)对酿酒酵母进行选育,并对其发酵性能进行了验证;其次结合重测序和转录组学分析手段,寻找与酵母耐酸性密切相关的基因,进一步通过基因敲除的手段验证基因在酵母细胞膜耐酸性中的作用,探索影响酿酒酵母耐酸性的代谢调控机制;最后将获得的菌株应用于青梅酒发酵,并对发酵青梅酒品质进行调控。本论文为青梅酒发酵提供理论依据和方法指导,主要研究结果如下:(1)以初步筛选到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae)ET008为出发菌株,通过ARTP、HTS和ALE相结合的方法,定向筛选出适用于青梅酒发酵的酿酒酵母ET008-c54,经过连续7代培养,证实进化菌株ET008-c54具有良好的遗传稳定性。与出发菌株ET008相比,ET008-c54在p H 2.5条件下的存活率由9.4%增加至95.8%,提高了10.2倍,发酵时间由22 d缩短至12 d,减少了45.5%;同时,关键风味化合物的总含量由17.8 mg·L~(-1)增加至27.0 mg·L~(-1),提高了51.9%,安息香醛的含量由1.8 mg·L~(-1)增加至2.8 mg·L~(-1),提高了54.3%,解决了青梅酒发酵时间长、风味不足和典型性特征不突出的问题。另外,ET008-c54的形态特征、活性氧、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性及对应基因的相对表达量变化进一步证明其具有优良的发酵性能,可作为生产发酵型青梅酒的潜在菌株。(2)运用二代高通量测序技术,对ET008和ET008-c54进行全基因组重测序,共获得1671个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)和639个插入缺失位点(insertion-deletion,Indel),对与耐酸性和关键风味物质有关的变异点进行分析挖掘。对ET008和ET008-c54进行转录组学分析,共鉴定出688个差异表达基因,其中364个基因显著上调,324个基因显著下调。通过全基因组重测序和转录组学联合分析,并结合生物信息学,发现在高度上调的基因中,与细胞膜组分、铁离子稳态、类固醇的生物合成相关的基因(ERG5、FRE1、IZH4、OPT2、INO1、GCN1、FET3、FIT2等)对酿酒酵母的耐酸性具有重要作用;与碳代谢、氨基酸代谢和脂肪酸合成等相关的基因(ARO7、ATF1、BAT1、EEB1、EHT1、OLE1等)参与了关键风味物质的合成。推测IZH4基因在ET008-c54细胞膜耐酸性中发挥了重要作用,为进一步优化和构建模式菌株提供更多的操作靶点。(3)利用CRISPR-Cas9技术敲除IZH4基因,验证了敲除菌株ET008-c54ΔIzh4(简称ΔIzh4)在p H 2.5环境下的生长受到明显抑制。从胞内微环境和细胞膜上进一步比较了ET008、ET008-c54和ΔIzh4在酸胁迫下的差异性,与ET008-c54相比,ΔIzh4的胞内p H(p H_i)和质膜H~+-ATPase略有下降,说明IZH4对胞内p H_i和质膜H~+-ATPase的影响不显著。ΔIzh4可以利用H~+-ATPase消耗更多的ATP,排出胞内H~+,从而维持酸胁迫下p H_i的动态平衡。在细胞膜水平上,ΔIzh4中不饱和脂肪酸和麦角固醇含量分别降低了38.8%和34.0%。此外,ΔIzh4的细胞膜通透性增加了10.8%,而其细胞膜流动性和细胞膜完整性分别降低了9.3%和46.5%。上述结果解释了ET008-c54良好耐酸性的原因,同时证明了IZH4基因是通过影响不饱和脂肪酸和麦角固醇合成等来调节细胞膜的完整性,进一步影响菌株的耐酸性。(4)以ET008-c54作为青梅酒发酵菌株,利用单因素实验和中心组合设计对青梅酒发酵工艺进行了优化,结果如下:初始糖浓度为200 g·L~(-1),发酵温度为20℃,料液比为1:2.0,发酵12 d后,可获得酒液呈金黄色、具有典型青梅香气、酒体丰满浓郁、口感纯正的发酵青梅酒(以FT表示)。利用高效液相色谱技术对市售的发酵青梅酒和FT的呈味物质(有机酸、氨基酸、酚酸和糖)进行分析比较,发现不同发酵青梅酒中各物质浓度差异较大,并利用Do T值(dose-over-threshold)确定了发酵青梅酒的11种呈味物质。采用气相色谱-质谱联用技术比较FT与市售发酵型青梅酒风味物质含量的差异,证明FT中风味物质的含量和种类明显高于市售发酵型青梅酒,并利用香气活力值确定了发酵型青梅酒的13种呈香物质。利用偏最小二乘法分析了发酵型青梅酒的呈味物质和呈香物质对感官属性的贡献性,发现柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、葡萄糖、果糖、蔗糖和单宁酸对青梅酒的呈味方面具有重要贡献,乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、异戊醇、里那醇和安息香醛对青梅酒的呈香方面具有重要贡献。200 L青梅酒放大规模试验结果表明,以ET008-c54发酵生产的发酵青梅酒的各理化指标和微生物指标均正常,呈味物质和呈香物质的种类和含量与三角瓶发酵基本一致且显著高于其他市售发酵型青梅酒,符合GB2758-2012和QB/T 5476-2020果酒通用技术要求的规定。