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化学—酶法催化生物质原料合成β-羟基-α-氨基酸的研究

龚磊  
【摘要】:羟醛缩合反应能够增长碳链,并且可以产生支链,在有机化学合成领域具有重要地位,其中β-羟基-α-氨基酸是一类可用于构筑多种生物活性天然产物和药物的重要合成砌块分子。本文针对苏氨酸醛缩酶对产物β-羟基-α-氨基酸C_β位选择性不高、反应转化率低以及绿色可持续制造的应用等问题,通过对羟醛缩合反应的调控与优化以及建立以生物质为原料的化学-酶法生产工艺,实现了β-羟基-α-氨基酸的绿色高效合成。具体研究成果如下:(1)开发了基于2,4-二硝基苯肼(DNPH)的高通量筛选方法用于苏氨酸醛缩酶(TAs)羟醛缩合活力的测定。以对甲砜基苯甲醛(MSB)为模式底物,在λ=485 nm处有特征吸收峰。对该方法的专属性、线性范围、检测限、加标回收率、稳定性、准确度以及对反应体系的适用性进行了评估。以来自Alcaligenes xylosoxidans的D-苏氨酸醛缩酶(Ax DTA)为模板酶,利用新建立的DNPH法应用其定点饱和突变文库的高通量筛选,经过初筛和复筛获得了2个对MSB活力提高的突变体Ax DTA_(D321C)和Ax DTA_(N101G),酶活力分别提高了1.5和1.3倍。利用该方法对Ax DTA及其突变体在羟醛缩合反应中的催化性能进行了高通量表征,对动力学参数、底物谱及反应进程进行了评价和分析。突变体Ax DTA_(D321C)的k_(cat)/K_m值(0.84 s~(–1)·m M~(–1))提高了58%。在对于脂肪醛、芳香醛和杂环醛等19种底物进行研究发现Ax DTA突变体对醛的接受范围比亲本更大。Ax DTA_(D321C)和Ax DTA_(N101G)催化MSB和甘氨酸的缩合反应的转化率比Ax DTA分别高13.9%和9.1%。因此,DNPH法在TAs的高通量筛选及羟醛缩合反应的表征中具有良好的应用前景。(2)通过基因挖掘技术和DNPH法筛选获得了酶活力和非对映体过量值(de值)较高的来自Achromobacter piechaudii的D-苏氨酸醛缩酶(Ap DTA),对其最适p H、最适反应温度、最适p H和温度稳定性等酶学性质进行研究。结果显示Ap DTA裂解和缩合活力的最适p H都为8.0,Ap DTA缩合活力最适温度为30℃。当p H 6.0时,Ap DTA裂解活力稳定性最好,而p H 8.0时,缩合活力稳定性最好。Ap DTA在4–30℃范围内具有较好的热稳定性。磷酸吡哆醛(PLP)和Mn~(2+)是Ap DTA所需的辅因子和金属离子,其最适添加量均为50μM。Ap DTA的V_(max)值为40μmol·min~(–1)·mg~(–1),K_m值为30 m M,k_(cat)值为27 s~(–1),k_(cat)/K_m值为0.9 m M~(–1)·s~(–1)。Ap DTA具有广泛的底物谱但对于体积较大和长链底物没有活力。在10℃,p H 6.0,加酶量为2 U和以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为助溶剂的条件下,对5 m M MSB底物进行缩合反应,获得最大产率和de值分别为60%和95%。当p H 7.0时,Ap DTA水相动力学拆分D,L-threo-对甲砜基苯丝氨酸(D,L-threo-MSPS)的转化率和对映选择性分别为45.2%和81%。当加入1,2-二氯乙烷和环己酮作为有机介质时,得到50%转化率以及对映选择性ee%99%。(3)为了拓展β-羟基-α-氨基酸的合成应用以及实现其绿色可持续制造,以固体废弃物粉煤灰为载体,合成了一种新型固体酸催化剂SO_4~(2–)/Sn O_2-Al_2O_3-CFA,并对其进行了SEM、FTIR、XRD、BET、EDAX和NH_3-TPD物理表征。当反应体系为20 g·L~(–1)木糖水解液,2.0 wt%SO_4~(2–)/Sn O_2-Al_2O_3-CFA,甲苯为有机介质(1:1,v:v),NH_4Cl为助剂(100 m M),在180℃下反应搅拌反应30 min后糠醛产率最高为84.7%,木糖转化率为93.5%。固体酸催化剂可循环使用5批次,糠醛产率没有显著降低。利用生物质糠醛的原位酶法转化生成呋喃丝氨酸(FLSE),实现了化学-酶法的级联工艺,在p H 8.0,反应温度30℃,50μM PLP且不添加金属离子的条件下将50 m M糠醛完全转化。因此,该化学-酶多步反应有效实现了从生物质到高附加值化学品的转化,具有潜在的应用价值。(4)为了进一步提高生物质原料的利用率以及实现过程更经济环保,开发了新型磁性固体酸催化剂Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2–)用于玉米芯高效地制备糠醛,对该固体酸进行了SEM、FTIR、XRD、BET、EDAX、VSM和Py-IR表征分析。在100 g·L~(–1)玉米芯,2 wt%Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2–)和180℃条件下,反应40 min后得到最高糠醛浓度为72m M;调节p H至8.0后直接加入固定化E.coli Pp LTA全细胞(相当于20 g·L~(–1)湿细胞)制备手性FLSE,最终产率为73.6%,ee%99%,de值为20%(threo)。该策略实现了中间物的分离最小化,减少了操作时间并提高了反应效率。固体酸预处理后的玉米芯酶解可得到葡萄糖浓度为45 g·L~(–1),是未处理的2.5倍,提高了酶解效率和原料利用率。固体酸和固定化全细胞催化剂可简单地从体系中分离,可重复再生使用5批次,具有良好的可重复利用性和稳定性。该化学-酶催化过程提供了从化石燃料转向生物质原料的可能性,可应用于呋喃衍生物的合成。


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