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海参肽抗疲劳的作用及机制研究

余毅豪  
【摘要】:疲劳影响着现代人的生活质量、生理健康以及精神状态。开发高效抗疲劳功能的营养调节补充剂是目前的研究热点。海参肽具有抗疲劳效果,但其抗疲劳的作用机制尚不清楚。本研究从促进脂肪分解代谢、促进糖异生、增强线粒体供能等方面探讨了海参肽的抗疲劳作用机制。此外,运用生物信息学方法,分析海参肽抗疲劳作用的生物学过程以及核心作用靶点,并进行实验验证。主要研究结果如下:1.海参肽抗动物疲劳的作用及机制研究。海参体壁酶解产物海参肽含量71.32%,分子量小于1998 Da占92.59%。采用7周龄C57BL/6J健康雄性小鼠64只按体重随机均分为对照组、低剂量海参肽组(0.7 mg/g·d)、中剂量海参肽组(1.4 mg/g·d)和高剂量海参肽组(2.8 mg/g·d)。饲喂第21天时,进行前肢握力实验,第25天时进行疲劳转棒实验,第30天时进行等时游泳实验,构建运动性疲劳模型,游泳结束后动物采血、取组织样品分析。主要研究结果如下:海参肽增加了小鼠的采食量,但组间体重无显著差异(p0.05)。与对照组相比,H-Scp组前肢握力、各海参肽组疲劳转棒时间均显著提高(p0.05),且均呈量效关系。海参肽改善了小鼠等时游泳后的氧化应激和炎症因子水平,血糖水平及组织糖原含量高于对照组,并降低了疲劳代谢标志物的含量。进一步发现,海参肽提高了肝脏、心脏和骨骼肌组织中的脂肪酸分解代谢能力,肝脏中PPARα、PGC1α、CPT1、LPL和PDK4的表达提高,心脏中PPARα和CPT1的表达提高,骨骼肌中PPARδ和CPT1的表达提高。海参肽提高了肝脏中糖异生能力,G6Pase和PEPCK的表达提高。此外,海参肽提高了心脏和骨骼肌中的线粒体拷贝数(Mt DNA)含量。等时游泳后,海参肽组心脏和骨骼肌中的ATP酶活性,COXI、PGC1α、NRF2、NRF1、TFAM、AMPK和SIRT1的表达高于对照组。以上结果表明海参肽维持了运动时的能量稳态以及提高了线粒体ATP生成能力。2.海参肽抗疲劳的生物信息学研究。首先,将DPPH·清除能力最强的海参肽组分使用UPLC-Q-TOF-MS/MS进行肽段鉴定,并对序列进行靶点预测。其次,通过转录组数据构建抗疲劳靶点集合。最后将海参肽构效靶点与抗疲劳靶点进行生物信息学方法分析。(1)经色谱分析鉴定得到的134条海参肽序列,通过SEA及Target Net服务器预测得到488个有效靶点。(2)通过对耐力训练相关的转录组GSE59088、GSE9013、GSE155271数据集进行差异基因分析,构建了含1762个基因的抗疲劳靶点数据集。(3)联立后得到海参肽抗疲劳潜在靶标的蛋白互作网络,主要生物过程包括“调节炎症反应”,“调节小分子代谢”,“应对缺氧及不同氧水平”,“调节钙离子稳态”等;其中“调节脂肪代谢”,“应对活性氧”,“炎症调控”和“钙离子稳态”与动物实验结果相符。分析还显示,NF-κB/STAT3/RELA/SRC,共同作用于IL-6和TNF-α的产生。(4)进一步对海参肽干预疲劳的蛋白互作网络进行分析,核心模块的关键基因ESR1可能与海参肽提高采食量作用相关。3.海参肽功能的细胞学验证试验。根据134条海参肽功能分析的结果,选择合成了海参肽P1(G(Hyp)LQADY)、P2(FD(Hyp)GA)、P3(LPGSDDF)、P4(APGLTY)肽段,对H_2O_2诱导的C2C12氧化损伤模型进行干预,验证其对氧化还原稳态以及炎症相关靶点的干预效果。结果表明,与模型损伤组相比,海参肽P1和P2在50μg/m L浓度时,显著提高了细胞活力和抗氧化能力,显著降低了IL-6和TNF-α的含量及表达,降低了NF-κB的磷酸化水平,提高了STAT3的磷酸化水平,表明P1和P2肽具有抗炎功效,符合生物信息的功能预测结果。综合本研究动物、细胞学和生物信息学分析实验结果,海参肽通过运动时增加肌组织糖原含量、加速脂肪分解代谢,提高线粒体拷贝数及ATP生成能力,降低氧化应激和炎症因子水平起到了抗疲劳作用。


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