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芦笋多酚结合热加工抑制酪氨酸酶活性的研究

于群  
【摘要】:黑色素的过量积累会引起果蔬褐变以及人体黑素瘤等皮肤疾病,酪氨酸酶(TYE)是黑色素生成过程中的关键酶和限速酶,目前常用的TYE抑制剂如曲酸和熊果苷等对人体有一定的副作用。因此,筛选高效低毒的新型TYE抑制剂具有重要的价值。芦笋味道鲜美,是一种热量低且营养价值高的蔬菜,其富含的多酚和皂苷等生物活性成分具有抑制TYE的潜力。为此,本文以芦笋为原料比较了不同干燥方式对芦笋营养品质及抑制TYE能力的影响;基于最佳干燥方式得到的芦笋粉末,通过超声辅助大孔树脂纯化芦笋多酚;将纯化后的芦笋多酚在高温反应釜中进行热加工,分析热加工对芦笋多酚抑制TYE活性的影响;同时研究了不同单体酚之间的相互作用;阐明了超声联合热加工和微波联合热加工对多酚和皂苷抑制TYE活性的影响,主要结果分述如下:研究了真空干燥(VD)、远红外干燥(FIRD)、热风干燥(HAD)和冷冻干燥(FD)对芦笋微观结构、色泽、活性成分和TYE抑制的影响。与FIRD、HAD和FD相比,VD芦笋粉末中总酚含量最高,为791.79μg/g·dw。不同单体酚与纤维素之间的吸附作用受多酚分子量、羟基以及苯环数的影响,VD芦笋粉末游离酚提取液中单体酚含量最高(没食子酸、芦丁、肉桂酸、阿魏酸和槲皮素分别为151.40μg/g·dw、117.90μg/g·dw、159.41μg/g·dw、244.46μg/g·dw和118.67μg/g·dw)。而FD样品具有较高的皂苷和叶绿素含量,分别为2.69 mg/g·dw和0.40 mg/g·dw。VD和FD样品的TYE抑制率明显高于FIRD和HAD样品,其中VD芦笋中游离酚提取液对TYE二酚酶的抑制率可达57.98%。而FD游离酚和结合酚提取液对单酚酶的抑制率可达到55.24%和62.26%。综合来看,VD是适用于保留芦笋多酚和抑制TYE的干燥方式。选择VD干燥的芦笋进行后续试验,通过超声波辅助大孔树脂纯化芦笋多酚。结果表明25℃下,60 W超声功率可以使多酚得率提升51.47%。温度为25℃~30℃,功率为24 W~60 W的超声处理可以明显提升D101树脂对芦笋多酚的吸附和解吸能力。大孔树脂吸附动力学分析表明一级动力学模型能更好地描述大孔树脂吸附芦笋多酚的起始阶段,二级动力学模型和粒子扩散模型能更好地预测大孔树脂对芦笋多酚的吸附行为。热力学分析表明Freundlich模型更适用于描述不同温度下D101大孔树脂对芦笋多酚的吸附。此外,超声处理可以将大孔树脂解吸芦笋多酚达到平衡的时间由60 min缩短至30min~40 min。超声处理可以使树脂对芦丁、阿魏酸和槲皮素的解吸能力较对照组而言分别提高1.72,1.20和1.62倍。为了增强芦笋多酚的抑制TYE活性,对初步纯化后的芦笋多酚(ASE)进行加热处理。经140℃90 min热加工后,芦笋多酚可以由8.14 mg/m L提高到18.33 mg/m L,TYE抑制率由3.26%增加到51.22%。其中,热加工前存在的反式4-羟基肉桂酸(CA)、阿魏酸(FA)和槲皮素(Que)在热加工过程中逐步消失;芦丁存在于热加工的整个过程中;香豆酸在热加工前并未检出而在热加工后出现。此外,热加工对ASE羟基自由基清除能力和还原力的提升效果比DPPH和ABTS自由基清除能力的提升更为明显。经过ASE和热加工的芦笋提取物(ASEH)处理的B16F10细胞出现大小减少、胞浆变性、核碎裂等形态学变化。各ASE和ASEH处理组的细胞活力都随着浓度的增加而下降。ASE在低浓度下对B16F10细胞黑色素的生成有促进作用而高浓度对其有抑制作用,ASEH比ASE具有更高的抑制能力。热加工过程中芦笋多酚的抑制TYE能力是由多种单体酚相互作用共同决定的。为了进一步探究不同单体酚之间的相互作用,首先测试了CA和FA对TYE的抑制作用,CA和FA对TYE的抑制率分别为12.15%和22.17%,而CA和FA联合处理(CA-FA)对TYE的抑制率可高达90.44%。一级动力学模型和Weibull模型分别较好地描述了添加2 m M~4 m M和6 m M~10 m M CA-FA后TYE的失活过程。分子对接结果表明CA和FA是通过丝氨酸282、组氨酸263和缬氨酸283等氨基酸残基与TYE活性空腔相互作用,从而抑制TYE。在37组不同单体酚组合的相互作用研究中,由Que、CA和FA组成的第11组多酚(Group11)协同效果最好。Group11属于竞争性抑制剂,抑制常数K_I值为0.239 m M。Group11的荧光猝灭机制属于静态猝灭,且其与TYE的结合能力远远大于Que,所形成的Group11-TYE复合物也更为稳定。在Group11与TYE的结合过程中,疏水作用是主要驱动力。Que、CA和FA可同时对接到TYE的不同活性位点,从而协同抑制TYE,其中阳离子-π、阴离子-π、静电作用及氢键是单体酚与TYE结合的主要作用力。基于CA、FA和Que对TYE的协同抑制作用,阐明了超声联合热加工以及微波联合热加工对Group11和皂苷抑制TYE能力的影响。120℃~150℃下加热30 min~120 min可以明显提高Group11与皂苷抑制TYE能力,且150℃下加热120 min后,Group11的TYE抑制率可达97.8%。超声联合热处理提高了Group11与TYE的结合常数,疏水相互作用是结合反应的主要作用力,超声联合热处理后生成新的化合物,名为2-羟基-3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-丙酸4-(2,3-二羟基丙基)-苯基酯。在700 W 20 min微波联合120℃30 min热处理中,原薯蓣皂苷和薯蓣皂苷的添加可以明显提高其抑制TYE的能力。荧光光谱分析表明TYE与多酚和皂苷结合的Ka值为1.09×10~5 L/mol~2.11×10~5 L/mol。超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS)分析表明皂苷的去糖基化反应以及酯类物质的生成是多酚抑制TYE能力提升的主要原因。


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