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固定化细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸的研究

代静新  
【摘要】:α-酮戊二酸(α-KG)作为一种重要的有机酸,广泛应用于医药、食品和精细化工等领域。目前,通过L-谷氨酸氧化酶(LGOX)转化生产α-KG受到越来越多的关注。同时LGOX作为工具酶和α-KG生产酶均具有很高的研究价值。本实验室前期成功构建了含LGOX的重组大肠杆菌催化L-谷氨酸生产α-KG的新路径,并通过发酵优化提高了LGOX的酶活。但仍存在稳定性较差,难以重复使用等问题。为了提高表达有LGOX的重组大肠杆菌的催化稳定性,本研究以该菌体固定化方法的构建为主要路线,研究了固定化重组大肠杆菌催化生产α-KG的工艺条件和催化性能。以下为主要研究内容:(1)以转化生产α-KG的催化效率和活性回收率为标准对不同固定化载体进行筛选。选择了ZIF-8-戊二醛(ZIF-8-GA)和聚乙烯醇-海藻酸钠(PVA-SA)这两种复合固定化材料,确定了固定化细胞的工艺参数。并对两种材料制备的固定化细胞的催化能力进行了对比,发现ZIF-8-GA具有更高的催化效率,可在16 h内催化100 g·L~(-1)底物转化生产95.81g·L~(-1)的α-KG。(2)对ZIF-8-GA制备的固定化细胞进行表征分析。首先通过流式细胞仪分析了材料对细胞形态的影响,发现加入ZIF-8和戊二醛之后,并未对细胞的活性产生影响。并分别通过X-射线衍射仪、傅里叶红外光谱仪、扫描电镜对固定化细胞进行结构分析,确定了ZIF-8可以涂层于细胞表面,且结构并未发生变化。(3)对固定化细胞的催化性能展开研究。ZIF-8-GA显著提高了游离菌对温度和p H的耐受性,分别在50℃和p H=9.0的条件下孵育16 h,固定化细胞的活性仍可以保持37.48%和40.27%。在对E.coli@ZIF-8-GA进行重复使用时发现,该固定化细胞循环使用至10个批次,转化L-谷氨酸(100 g·L~(-1))生产α-KG的产量仍能达到70.03 g·L~(-1),改善了游离细胞在反应中稳定性差的问题。此外,将E.coli@ZIF-8-GA放置4℃冰箱保存14天,ZIF-8-GA固定化细胞活性仍能保持60.23%,相应的游离细胞活性仅有8.37%。(4)固定化酶的制备和优化。使用ZIF-8进行固定化酶的制备时发现吸附率仅有45%。通过引入聚天冬氨酸(PASP),发现固定化酶的吸附率提高至90%。其次,优化了ZIF-8在制备过程中的添加量,当2-甲基咪唑和醋酸锌的浓度为160 m M和40 m M时,固定化酶的活性回收率为89.66%。随后考察了ZIF-8对LGOX的保护效果,将固定化酶分别暴露于胰蛋白酶(5 g·L~(-1))、尿素(5 M)和高温(60℃)的条件下60 min,相对活性分别保持了87.16%、74.53%、81.07%,而游离酶的相对活性仅为27.72%、19.11%、16.89%。最后,对固定化酶的催化耐久性展开研究,发现重复使用10批次后固定化酶的相对活性仍保持在90%以上。


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