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超声波加速胰蛋白酶反应及其机理的探讨

朱少娟  
【摘要】:酶法对食品蛋白质进行改性,是有效改善蛋白质的物理、化学性质,提高适口性、贮存与营养特性的技术。近年来,声学技术向生物、食品技术领域不断交叉、渗透,应用超声技术在水溶液中提高酶活力、促进酶催化反应已有一些研究报道,但不同酶、底物作用效果不尽一致,作用机理尚不清楚。本论文以胰蛋白酶水解酪蛋白为模型,研究超声波对胰蛋白酶水解酪蛋白的酶反应条件、动力学的影响及其反应机理。 首先通过单因素实验确定了促进酶解反应的适宜超声参数。超声功率为225W、超声频率20KHz,超声时间与间歇时间比为1:1,超声时间10min。进一步研究了适宜超声条件下的胰蛋白酶反应动力学。测定了超声场下温度,pH,底物浓度,酶浓度对水解率的影响,计算胰蛋白酶米氏常数Km、最大反应速度Vm。结果表明,超声波不改变胰蛋白酶的最适pH;但影响胰蛋白酶的温度特性,在5℃,20℃超声波作用下,水解率分别达54%和73%,比同温度对照提高了4.4倍和2.33倍;而超声波不改变木瓜蛋白酶温度和pH特性。本试验超声条件下,胰蛋白酶的米氏常数Km减小,最大反应速度Vm增大;超声场下酶浓度为0.02%、0.04%时的水解率分别与对照酶浓度为0.08%、0.2%时的水解率相当。超声波提高胰蛋白酶水解效率,超声反应10min可达到常规反应40min时的水解率,并可节约酶用量,降低生产成本。 高效液相色谱排阻法测定了胰蛋白酶在超声10min、未超声10min\40min条件下水解物的分子量分布。超声波不影响胰蛋白酶的特异性,但影响酶解产物的分子量分布。常规条件下水解40min产物肽总量(总峰面积)与超声水解10min接近,但200-2000分子量肽量高16%;常规条件下水解40min与10min相比,肽总量提高54.8%,小分子肽含量增加。 对超声波促进胰蛋白酶酶解反应的机理进行了初步的探讨。通过紫外及荧光光谱法测定,观察到超声波影响酶及底物分子构象,适宜的超声波改变了酶与底物的荧光吸收光谱和荧光强度,可能使酶的活性中心更暴露,底物结构更松散,促进酶与底物的结合。通过Arrehnius作图分析了超声波对酶反应活化能的影响,结果表明超声波降低了酶解反应的活化能,加速传质,降低了底物和产物对反应的抑制作用,适宜的超声波提高胰蛋白酶水解效率。


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