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地衣芽孢杆菌0204高温α-淀粉酶编码基因的克隆、序列分析和初步表达

徐敏  
【摘要】:耐高温α-淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一,广泛应用于发酵、制糖等工业。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)0204是国内生产高温α-淀粉酶的代表菌株之一。本文主要研究地衣芽孢杆菌0204高温α-淀粉酶(BLA)编码基因(amyl)的克隆、序列分析及在大肠杆菌和地衣芽孢杆菌中的初步表达。 根据已知α-淀粉酶编码基因的核苷酸序列进行比对分析,利用获得的保守区序列设计一对引物扩增出一段B.licheniformis 0204 α-淀粉酶编码基因内部1.0kb大小的基因片段(amyl’)。将该基因片段直接连接到pGEM-T Easy上,转化大肠杆菌XL-1,得到了重组质粒pGEM-T-amyl’。通过序列测定,确认amyl’序列与来源于其他芽孢杆菌α-淀粉酶编码基因具有高度相似性。再利用反向PCR技术,以自身环化的染色体部分酶切片段为模板,PCR扩增得到了amyl’两侧的DNA序列。测序后,与amyl’片段序列拼接,得到了完整的全长淀粉酶基因序列。通过基因及其氨基酸序列比对发现,所克隆出的基因与NCBI公布的B.licheniformis 584 α-淀粉酶具有高度相似性;与除环状芽孢杆菌外的芽孢杆菌属来源的α-淀粉酶也具有很高的相似性。 为了确定克隆基因的功能,构建了含B.licheniformis 0204高温α-淀粉酶结构基因的重组质粒pET28a-amylNEW并在大肠杆菌中表达。酶活测定显示,重组大肠杆菌表达13.5U/mg的α-淀粉酶,SDS-PAGE结果表明,在55 kD附近出现了明显的蛋白条带,与理论推导的蛋白质量相一致。进一步对该重组酶进行酶学性质分析,结果表明,重组酶的酶学性质与B.licheniformis 0204耐高温α-淀粉酶的性质一致。由此表明,克隆出的amylNEW为B.licheniformis 0204 α-淀粉酶编码基因。 为了在地衣芽孢杆菌中表达B.licheniformis 0204高温α-淀粉酶,构建了整合片段amyl-Ωkm。首先PCR扩增出了B.licheniformis 0204高温α-淀粉酶全长基因amyl,该全长基因包括了启动子和信号肽序列。然后与卡那抗性基因ΩKm相连接。连接产物直接转化B.licheniformis 0204后得到的整合重组子酶活测定显示,最高的重组子酶活为33U/mL,比对照菌株只高出10%。 与大肠杆菌感受态细胞的形成相比,地衣芽孢杆菌感受态细胞的形成要困难得多。本文用电转化方法研究了高渗溶液对地衣芽孢杆菌电转化率的影响。在最佳的转化条件下:生长培养基为LB+0.1 mol/L山梨醇,复苏培养基为LB+0.7 mol/L甘露醇,电场强度为20 kV/cm,地衣芽孢杆菌0204最高电转化率为9.8×10~2CFU/μg。


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