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曲霉产壳聚糖酶酶学性质及作用机理研究

陈小娥  
【摘要】:壳聚糖酶是一种专一性降解壳聚糖的水解酶。壳聚糖酶在工业上,可用于制备功能性甲 壳低聚糖,在农业上可作为生物控制剂,提高植物的抗病能力;在生物技术方面,可以用壳 聚糖酶并辅以其它手段制备真菌原生质体,为细胞分子生物学提供工具酶。本论文以土壤分 离获得的壳聚糖酶产生菌曲霉CJ22-3为基础,对菌种进行了诱变改良、摇瓶培养基和培养条 件的优化、10 L发酵罐的扩大培养条件控制、酶的分离提取和纯化、纯化酶的酶学性质和酶 解作用模式研究以及酶法制备甲壳低聚糖的工艺研究。主要研究内容和结果如下: 1. 通过壳聚糖为唯一碳源的选择性平板筛选培养基的分离筛选,从65份土样中筛选得到 了45株产壳聚糖酶菌株;再以透明圈与菌落直径比值的大小,结合摇瓶复筛,采用DNS法和 粘度降低法来判定酶活高低;对产壳聚糖酶活力较高的菌株,采用TLC、HPLC、MS法进行 酶解产物分析。结果表明:菌株21-3、 22-3的酶解产物相近,均为一糖至五糖;结合菌株的 培养特性,选择菌株22-3作为进一步试验菌株,命名为CJ22-3。根据CJ22-3的菌落、顶囊、分 生孢子头、分生孢子的特征,确定它为曲霉。对该菌株的发酵液以及酶解所得产品进行急性 毒性试验,证明它是安全的。 2. 实验发现易利用碳源对野生菌株曲霉CJ22-3产壳聚糖酶产生阻遏;曲霉CJ22-3产生 的壳聚糖酶受转录子控制。为此建立了在平板筛选培养基上添加0. 1%Triton-100抑制剂和2 %葡萄糖来筛选诱变突变株。以曲霉CJ22-3为出发株,经紫外诱变和60Co诱变,最终获得 高产菌株CJ22-326,其产酶活力为出发株的1. 54倍,经培养基优化和发酵条件优化后摇瓶产 酶达3. 06 u/ml:在10 L机械搅拌罐上进行放大试验,酶活为3. 65 u/ml,比摇瓶高19%。 3. 对曲霉CJ22-326菌株培养液采用减压浓缩和75%乙醇沉淀的方法来提取壳聚糖酶, 酶收率达75%以上。该酶经CM-Sepharose FF离子交换色谱、Sephacryl S-200凝胶过滤色谱 和Phenyl Sepharose CL-4B疏水色谱分离纯化技术,分离得到两种壳聚糖酶组分ChiA和ChiB, 对ChiA和ChiB经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定均为单一色带,其相对分子质量分别为106. 2 kDa 和29. 0 kDa;采用Sephacryl S-200凝胶过滤色谱测定的相对分子质量则分别为96 kDa和 28. 9 kDa,两种方法测定结果基本一致,说明他们是单体酶。对最终纯化的ChiA和Chi B分 别采用反相色谱进行纯度分析,其纯度分别达到92%和94%。 4. 对两种单体酶的酶学性质进行了系统的研究,结果表明:ChiA和ChiB最适pH分别 为4. 2和5. 8,稳定的pH范围分别为pH 4. 0-6. 0和pH 5. 5-7. 5;最适作用温度分别为50℃和 65℃,两者在低于50℃保温时,热稳定性都较好,但在高于60℃时,ChiB比ChiA热稳定性 要高。2. 5mmol/L的Ag+、Fe3+和1mmol/L的Hg2+对ChiA和ChiB均有较强烈的抑制作用。 lmmol/L的Mn2+对ChiA和ChiB均有强烈的激活作用,2. 5mmol/LCu2+、Cd2+、Pb2+对Chi B 有抑制作用,其它金属离子对ChiA和ChiB酶活无多大影响。在低底物浓度时,ChiB酶反 应能很好地满足米氏方程,表观米氏常数Km为0. 7749 mg/mL,Vmax为0. 272 u/ml;而在 底物浓度超过1mg/mL时,反应速度反而随底物浓度升高而下降,即表现出底物抑制作用。 摘要 ChiA酶反应能很好地满足米氏方程,米氏常数Km为8.7494mg/inl,Vmax为0.778 u/ml。 ChiA和Ch沮具有高度的底物专一性,除了对不同脱乙酞度的壳聚糖有作用以外,对几丁质 和CMC没有水解活力。两者的反应速率均随底物脱乙酞化度的提高而增加。 5.通过测定酶解液体系粘度和对酶解产物的TLC、1于LC分析,在国内首次深入地研究 并报道了内切、外切壳聚糖酶的酶解作用模式,结果表明:酶ChiB是一种内切酶,以内切方 式水解壳聚糖的p一(1,4)糖昔键,即作用于GlcN一GlcN、GlcN一GlcNAc和域GlcNAc一GlcN 糖昔键,不能作用于GlcNAc一GldNAc糖昔键;酶解终产物以壳三糖、壳四糖、壳五糖为主。 以低聚糖为底物的水解产物分析表明,壳五糖是可以适当速率进行水解的最低聚合度的底物, 水解产物为壳二糖和壳三糖,壳六糖主要被水解成壳三糖。酶ChiB不水解壳四糖,对壳五糖 的水解速率较慢,这一特点非常有利于用它来生产聚合度相对高的壳寡糖。酶ChiA是一种 外切氨基葡萄糖昔酶,主要从壳聚糖或壳低聚糖分子一端(非还原端)依次切下氨基葡萄糖 残基。它只作用于GlcN一GlcN和GlcN一Gl创NAe糖昔键,不能作用于GleNAe一GlcN和 Gl比认c一GlcNAc糖昔键。 6.以不同脱乙酞化度的壳聚糖为原料,采用曲霉发酵液超滤(膜分子截留值50000)后 的内切酶进行酶法制备甲壳低聚糖,形成了甲壳低聚糖酶法生产新工艺。其优化工艺条件为: 水解底物浓度为3%左右,pHS.o一5 .8,酶用量在4一6可g壳聚糖。采用Na0H溶液调PH至8 左右,在波长600Inn下测其透光率,当透光率达到78%左右,即可终止酶解反应,该方法 可方便、快速和准确地控制酶解反应。甲壳低聚糖产品得率达94%以上。该产品理化指标为 水溶性99.5%以上,无单糖,聚合度在3以上,灰分0.6%


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