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苦瓜降糖多肽-P的分离纯化及降糖机理研究

盛清凯  
【摘要】:苦瓜(Momordica charantia)为葫芦科苦瓜属一年生草本植物,分布于东非、亚洲、南美等世界各地,我国各地都有种植。长久以来,人们用苦瓜粉、苦瓜汁、苦瓜有机提取物治疗糖尿病,并对其中的功能成分进行了长期探索。目前大量实验表明,苦瓜中存在多肽类和苷类等多种降糖活性成分。本文确定以俗称“苦瓜植物胰岛素”的苦瓜降糖多肽-P ( P-polypeptide )为研究目标,对其分离纯化方法、2型糖尿病降糖机理、糖尿病并发症改善、物理性质、结构和构效关系进行了系统研究。 确定苦瓜降糖多肽-P为研究目标。用超滤方法对苦瓜中的降糖肽进行初步筛选。用分子质量为10kD、3kD和1kD超滤膜对苦瓜汁进行三级超滤,对其超滤和截留组分进行糖尿病动物实验。结果表明,3kD和1kD间的截留组分口服,可降低正常和四氧嘧啶糖尿病模型鼠的血糖,其它组分口服无降糖效果。通过对苦瓜汁组分分析,表明苦瓜中含有苦瓜多肽-P。 用凝胶柱层析和反相高效液相色谱方法分离纯化苦瓜多肽-P。采用动物降糖实验、薄层层析、电泳及氨基酸组成分析方法鉴定,用凝胶柱层析和反相高效液相色谱方法分离纯化苦瓜多肽-P。用Edman降解方法首次对苦瓜多肽-P进行了氨基酸序列测定,结果表明苦瓜多肽-P为由166个氨基酸残基组成的多肽。凝胶柱层析和反相高效液相色谱方法便于大量制备,优于过去的薄层层析制备方法。 对苦瓜多肽-P的降糖功能进行了研究。腹腔注射大鼠链脲霉素与饲喂高脂日粮结合,建立肥胖型2型糖尿病动物模型。皮下注射苦瓜多肽-P,可降低2型糖尿病肥胖模型大鼠的血糖,改善葡萄糖耐量,降低血清胰岛素的浓度,升高肝脏和肌肉中糖原的含量。苦瓜多肽-P还可降低糖尿病模型大鼠的胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平,升高高密度脂蛋白的含量,调节血脂异常代谢。苦瓜多肽-P还可降低2型糖尿病模型大鼠血清和肝脏的过氧化氢、丙二醛浓度,增强血清和肝脏超氧化物酶活力,提高机体总抗氧化能力,改善糖尿病并发症。苦瓜多肽-P降糖机理在于提高组织对胰岛素的敏感性,改善胰岛素抵抗。 采用生物信息学方法首次对苦瓜多肽-P进行序列分析和结构预测。结果表明,苦瓜多肽-P的分子质量为17702.7D,分子式为C763H1233N217O256S5。苦瓜多肽-P为酸性多肽,理论等电点4.86,非球形结构,可被多种酶水解。采用BLASTp同源比较,结果表明苦瓜多肽-P的氨基酸序列与数据库中蛋白质或多肽序列相似性小于30%,与动物胰岛素无同源性。采用PDH、NNPREDICT、GOR三个服务器进行二级结构预测,结果表明苦瓜多肽-P二级结构至少含有3个β折叠和1个α螺旋,其中其氨基酸序列28-31(-Cys-Leu-Tyr-Glu-)区域、86-88(-Glu-Cys-Ile-)区域、104-106(-Leu-Ile-Val-)区域为β折叠、127-133(-Lys-His-Ala-Ser-Glu-Val-Lys-)为α螺旋。28-31


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