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食品中黄曲霉毒素B_1金标免疫层析检测方法研究

孙秀兰  
【摘要】:强的化学致癌物质,广泛存在于各种食品和饲料中,严重威胁人类和动物的生命安全。目前的检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐,已无法满足现场快速检测的要求。因此,研究和建立一种方便、安全和快速的检测方法意义深远。在此,作者以单克隆抗体和纳米金合成标记技术为基础,根据免疫层析的原理,建立了快速、简易的食品中AFB1的纳米金标免疫层析检测方法,并对其相关机理进行了深入探讨。 首先通过碳二亚胺法合成AFB1与BSA偶联物,构建AFBl完全抗原。反应起始摩尔比为AFB1-O:载体蛋白BSA 20:1,采用二甲基甲酰胺DMF和PBS(PH7.4)溶液混合溶剂系统,所得偶联物中AFB1-O与BSA的摩尔比为9.34.:1,AFB1-O的利用率为46.7%。通过荧光光谱研究偶联反应对BSA的构象影响。结果表明,AFB1-O对BSA具有荧光猝灭作用,偶联反应使得BSA疏水性增加。将AFBl完全抗原免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合、亚克隆和扩大培养,成功筛选出2株稳定分泌特异性抗AFBl单克隆抗体的细胞株,分别为3A7和5D3。3A7和5D3产生的单克隆抗体效价分别为20,0000和7,0000,亲和常数分别为3.81×10~7和3.43×10~7L/mol,亚类类型均为IgG2a与AFB2、Gl、G2和M2无明显交叉反应,与AFM1呈现出弱的交叉反应,分别为4.08%和2.33%。 以10nm金溶胶为例,正交实验优化单分散性金溶胶合成条件。获得的金颗粒平均粒径为10.7 nm,变异系数14.2%。通过紫外.可见光光谱研究不同粒径纳米金溶胶形成过程,探讨反应动力学特征和反应机理。结果证实,反应的初级阶段形成大的空心球体晶核,然后在球体内部逐渐生成小金原子聚集体,聚集体不断分散,逐步形成一定直径的金胶颗粒。球体晶核生成小颗粒聚集体的时间由还原剂的量决定。动力学分析显示,后期反应近似符合一级反应规律。合成了五种不同粒径的金溶胶(10~70 nm范围),并对其进行了表征,结果表明,金溶胶粒径均一,变异系数均小于15%,平均粒径分别为10.7nm,14.4 nm,25.1 nm,36.9nm,67.4nm。 通过研究纳米金溶胶与AFB1单克隆抗体(McAb)作用过程,确定稳定标记上述五种粒径金溶胶McAb的最适浓度分别为0.07,0.051,0.033,0.019,0.012 mg/ml,作用时间为5min,pH为7.4。将金标探针复合物进行透射电镜,红外光谱和免疫反应性鉴定,结果表明,McAb的红外光谱未发生明显改变,McAb的免疫亲和常数由3.81×10~7提高到4.14×10~7,效价由20,0000提高到22,0000,常温贮藏60d时,稳定性由42%提高到53%。 通过荧光光谱和圆二色谱研究纳米金与AFBl单抗McAb的相互作用机理。结果表明,纳米金对McAb产生静态猝灭,猝灭的速率常数随着温度升高而降低。产生荧光猝灭的原因是,McAb的色氨酸残基与纳米金颗粒之间发生了FOrster偶极一偶极无辐射能量转移。纳米金溶胶与McAb结合位点数为0.8928,结合常数KA为7.009×10~3。根据反应前后热力学焓变⊿H和熵变⊿S,判断氢键和范德华力为纳米金溶胶与McAb之间的主要作用力。二者反应后McAb所处环境的极性未明显改变。McAb的构象组成发生了变化,a-螺旋含量由原来的52.5%升高至54-2%,β-折叠的含量由21.O%降低至19.8%,转角含量由4.6%升高至7.3%,无规则卷曲20.2%略升高至20.5%。McAb与金纳米粒子作用后整体


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