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环糊精糖基转移酶和γ-环糊精生物合成的研究

曹新志  
【摘要】:对一株嗜碱芽孢杆菌Bacillus alkalophilus 1177进行了紫外和γ射线诱变选育,并采用酚酞变色圈快速筛选法筛选出的有较高环糊精糖基转移酶活性的菌株,其酶活提高了1.76倍。 发酵实验结果表明酵母膏是培养基主要组成成分中影响酶产量的最主要因素。通过单因素试验和正交试验获得该菌株产环糊精糖基转移酶的最佳条件为:接种量3%;培养温度30℃;pH10.5;发酵培养基的组成为玉米粉2%,酵母膏1.5%,玉米浆5%;250ml三角瓶装液量为30ml;270rpm振荡培养3天,其发酵液酶活可达5400 U/ml。10升罐发酵也表明:酶活有显著提高,可达5820 U/ml。这比文献报道的酶活高。 本实验通过一系列纯化步骤获得了电泳纯的环糊精葡萄糖基转移酶,粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose 52离子交换分层析、Sepharose CL-6B凝胶层析后,所得样品酶的比活力为5753U/mg,纯化倍数为9.54,回收率为18.9%。样品经DEAE-Cellulose52离子交换分层析后,SDS-PAGE电泳检测显示有多条蛋白带,表明还有一些杂蛋白质没有除去。样品经Sepharose CL-6B凝胶层析后,SDS-PAGE电泳检测显示只有一条蛋白带。表明已获得纯化的环糊精葡萄糖基转移酶。酶以淀粉为底物时的米氏常数Km为1.24mg/ml和最大反应速度Vmax 114.9μg/min。该Km较小,表明此酶对淀粉有较强的亲和力。并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定其分子量为69kDa。 我们用巯基乙醇和沸水分别处理环糊精葡萄糖基转移酶后,再用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定,两种方法获得的相对迁移率相同,这表明该酶没有亚基。并且该酶的其它酶学性质与以前报道的也不完全相同,这说明酶的来源不同,其酶的组成和性质也会不同。 该酶的活力分别在pH5和pH8.5出现两个高峰,相对酶活分别达到97%和100%。该酶基本上在pH6.0-10.0范围内基本稳定,能维持酶活在90%以上。酶的最适温度为60℃;此酶在70℃以下基本保持稳定,高于70℃酶开始失活。说明该酶对温度不太敏感,稳定性较高。 Ag~+、Cu~(2+)、Mg~(2+)、Al~(3+)、Co~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)对酶活有明显的抑制作用,Sn~(2+)、Mn~(2+)对酶活力有一定的抑制作用,K~+、Ca~(2+)金属离子对酶活力没有影响。 用几种蛋白质侧链修饰剂对环糊精糖基转移酶进行修饰,在一定反应条件下,该酶被氯氨-T(Ch-T)、丁二酮(DIC)、苯甲磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)和巯基乙醇(α-mercaptoethanol)修饰后,酶活力不受影响,说明蛋氨酸、精氨酸、氨基酸的羟基和巯基与酶活力无关。而该酶被焦碳酸二乙酯(DEP)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)和羰二亚胺盐(EDC)修饰后,酶活力大幅度下降。表明有可能组氨酸残基、色氨酸残基


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