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钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇的研究

陈雪岚  
【摘要】:L-精氨酸是人体代谢的一种重要氨基酸。随着人们对它研究的深入,发现精氨酸在食品和医药等方面有广泛的应用前景。本文以我国氨基酸生产常用的菌株钝齿棒杆菌A.S.1.542和本实验室保存的经亚硝基胍诱变的钝齿棒杆菌A.S.M2(精氨酸的产量能达2mg/mL)为研究对象,首次报导了钝齿棒杆菌A.S.1.542生物合成精氨酸的相关基因的信息,并与钝齿棒杆菌A.S.M2的相应基因进行了比较;同时,通过基因敲除技术分析了精氨酸生物合成中的一个调控基因argR的功能,并构建表达载体pC2-P-argR-T以考察argR基因对钝齿棒杆菌A.S.M2产精氨酸的影响。本文同时采用亲和层析的方法对钝齿棒杆菌A.S.M2产精氨酸关键酶进行了研究。主要研究结果如下: 1通过Southern Blotting实验,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的argB基因为探针,确定钝齿棒杆菌A.S.1.542与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032有较高的同源性。据此,本实验以谷氨酸棒杆菌产精氨酸的串联基因的序列为主,同时比对已报道的Corynebacterium diphtheriae gravis NCTC13129、Corynebacterium efficiens YS-314和Mycobacterium tuberculosis CDC1551生物合成精氨酸基因簇argCJBDFR的保守序列,设计了四对特异引物,采用PCR的方法从钝齿棒杆菌A.S.1.542中扩增了长为6080bp的序列,其中argJ、argB、argD、argF和argR获得完整开放阅读框,argC获得部分开放阅读框。通过Blastp比对,分析了这5个完整开放阅读框的特征信息。 2采用同样的四对特异引物,通过PCR方法从钝齿棒杆菌A.S.M2中扩增了长为6083bp的序列,同样获得5个完整的开放阅读框。比较了钝齿棒杆菌A.S.M2和钝齿棒杆菌A.S.1.542这5个基因的不同,从生物信息学上分析钝齿棒杆菌A.S.M2产精氨酸得以提高的可能原因。 3鉴于argR基因的活跃性,本实验构建了一个敲除型质粒pGEM-T-RKR分析钝齿棒杆菌中argR基因的功能。通过分析精氨酸的产量和argB基因编码的乙酰谷氨酸激酶的含量,推断argR基因在钝齿棒杆菌生物合成精氨酸途径中扮演正调控因子。同时构建了一个表达型载体pC2-P-argR-T以考察argR基因对钝齿棒杆菌A.S.M2产精氨酸的影响,结果显示没有达到使精氨酸产量提高的目的。 4采用亲和层析和SDS-PAGE方法分析钝齿棒杆菌产精氨酸关键酶。实验表明此菌


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