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基因重组毕赤酵母表达阿片肽对小鼠免疫作用及其机制研究

韩飞  
【摘要】:阿片肽是一类生物活性多肽,在神经内分泌与免疫调节中起重要的调节作用,具有镇痛,镇静,调节免疫,促进摄食,调节睡眠,缓解压力和紧张,抑制胃肠道运动和消化液分泌,影响生殖和泌乳,调节心血管系统功能等生理活性,其在医药和动物生产中有着广阔的应用前景。 本研究从基因重组阿片肽发酵表达条件的优化开始,使用新的阿片肽定量研究方法,进行了基因重组阿片肽的分离纯化工作,并结合国内外研究现状,着重研究了分离纯化得到的3种阿片肽对小鼠非特异性免疫,细胞免疫和体液免疫各项指标的影响;利用RT-PCR方法,从基因转录水平,研究了体内两种给药方式下3种阿片肽对小鼠体内不同脏器组织的μ阿片受体,δ阿片受体以及肽转运载体PepT1 mRNA丰度变化情况;初步研究了阿片肽对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫调节作用。 1.利用基因重组毕赤酵母发酵表达阿片肽 对基因重组毕赤酵母的表达条件进行了优化。结果表明,毕赤酵母对外源阿片肽表达的最优摇瓶发酵条件为:培养基BMMY(pH5.6),甲醇诱导浓度0.75%,菌体起始浓度40 OD600,摇床设定温度28℃,转速250转/分钟。按以上条件进行表达,N-Tyr肽含量达到了201.1mg/L。 2.阿片肽的提取分离和活性鉴定 建立了一套基因重组阿片肽的分离纯化方法。将基因重组毕赤酵母经适宜的生长和表达培养后,所得的发酵液经离心得无细胞上清液,上清液超滤后过Sephadex G-10柱,将所得具有阿片活性的粗品用HPLC-MS分析,依据分子量确定活性组分中可能存在的阿片肽,然后根据这些阿片肽的等电点和疏水性,利用?KTA Purifier 100快速纯化系统的DEAE-阴离子交换柱和Sephasil peptide C18反相高压液相柱分离得到六种阿片肽,鉴定纯度后测定其氨基酸组成。六种阿片肽分别为YGGFM、YGGFMT、YPFPGPI、YPFPGPIR、YPFPGPIRYG和YGGFMTSEK,其中YGGFMT、YPFPGPIR、YPFPGPIRYG和YGGFMTSEK目前尚未见报道。 3.不同类型阿片肽对小鼠免疫细胞的免疫作用 从分离纯化出的六种阿片肽中选出OP1(YPFPGPI,β-CM-7)、OP2(YPFPGPIRYG)和OP3(YGGFM,M-Enk)三种阿片肽进行后续的研究工作。利用体外细胞培养法研究三种阿片肽对小鼠的免疫作用。研究发现,三种阿片肽对体外培养小鼠的免疫细胞呈双向调节作用。阿片肽的浓度一般在10-7mol/L时,刺激或抑制作用表现最强。且体外培养实验表明,OP1对胸腺和脾细胞的作用是通过胸腺和脾细胞上的经典阿片受体和非经典阿片受体(能够被阿片受体拮抗剂纳酪酮逆转的为经典阿片受体,反之为非经典阿片受体)共同完成的;OP2和OP3对胸腺和脾细胞的作用是完全通过胸腺和脾细胞上的经典阿片受体完成的。 4.体内法研究不同类型阿片肽对小鼠的免疫作用 采用腹腔注射和饮水中添加阿片肽的方法研究阿片肽对小鼠的免疫调节作用。研究


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