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草菇cDNA削减文库的构建及三种多聚糖降解酶基因的克隆与表达

李迅  
【摘要】:食用菌能够利用废弃的木质纤维素类物质作为生长基质,通过生物转化将其转变为具有较高附加值的食品或药用子实体。草菇(Volvariella volvacea)主要生长在热带和亚热带地区,是世界第五大食用菌培育品种。它以稻草等秸秆为生长基质,生长温度比其它中温真菌高,这些特性显示其纤维降解酶系可能具有更好的温度稳定性。本文的研究内容是构建草菇cDNA削减文库,为建立高等担子菌基因高效表达体系提供有力的基因工程方面的支持;克隆一些有价值的多糖降解酶,并对它们的外源表达进行探讨。 1.首先确定草菇中半纤维素酶和纤维素酶最佳mRNA丰度的诱导条件为:xylan和CMC各0.2%;(NH_4)_2SO_4 0.2%;KH_2PO_4 0.2%;VB1 2.5 mg/L;MgSO_4 0.1%;pH 7.5;150 rpm的转速培养。改进了担子菌草菇的总RNA抽提方法,用此方法获得的RNA满足了后继的cDNA合成需要。介绍一种改进的利用差异杂交和定向插入的方法构建全长cDNA削减文库,分别以诱导和非诱导条件培养草菇菌丝,两者都提取mRNA,由PowerScript~(TM)逆转录酶将诱导菌丝提取的mRNA逆转录成cDNA第一链,用得到的cDNA第一链和非诱导菌丝提取的过量mRNA进行杂交,将未杂交上的cDNA第一链洗脱浓缩后,用SMART~(TM) cDNA Library Construction试剂盒构建成草菇cDNA削减文库。经检测:原始文库滴度为2.5×10~5 pfu/ml,重组率为93%,插入cDNA大小在0.5~4.0 kb之间,文库扩增后,文库滴度为1.1×10~9 pfu/ml。 2.首次发现草菇中木聚糖酶基因的mRNA大规模异常剪辑现象,发生了内含子错读或外显子错误剪辑,形成不正常的mRNA。这可能是草菇适应环境一种调节方式,来满足


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