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甲壳低聚糖性质、分级及免疫活性研究

魏新林  
【摘要】:本论文在研究甲壳低聚糖理化和功能性质的基础上,着重研究了甲壳低聚糖(COS)的分级分离、活性筛选、定量、结构鉴定和免疫活性及机理,对于促进甲壳素壳聚糖的研究、推动甲壳低聚糖免疫功能食品和抗癌药物的开发具有重要的学术意义和很大的应用价值。 对甲壳低聚糖(COS)的理化和功能性质进行了研究,结果表明:平均相对分子质量为1389、脱乙酰度(DD)为91%的COS在pH1~13的范围内都有优良的水溶性,当pH5.1时,COS在水中的溶解性略有下降,COS在乙醇中的溶解性随着乙醇浓度的增加而下降;当pH9.7时COS显示阳离子性质;当温度80℃,COS溶液较稳定,在pH2~5.5下COS溶液的热稳定性较好,DSC分析COS热分解温度为211~219℃;COS有优良的吸湿保湿性;COS对淀粉老化具有显著的抑制作用。 用膜分离、乙醇分级沉淀和柱色谱相结合的分离手段,对COS进行分级分离,并以体外淋巴细胞增殖和体内巨噬细胞吞噬、半数溶血实验相结合的方法对分离产物跟踪筛选免疫活性组分。首先从超滤截留COS(UFR-COS)和纳滤截留COS(NFR-COS)中筛选出免疫活性组分—NFR-COS,其次从NFR-COS的75%醇析沉淀(COS-75SE)、87.5%醇析沉淀(COS-87.5SE)、87.5%醇沉上清组分(COS-87.5SU)中,筛选出平均分子量为766的免疫活性组分COS-87.5SU;然后通过离子交换树脂CM-Sephadex C-25,将COS-87.5SU采用0.01MpH4.8的缓冲液洗脱后,用0—1.2N的NaCl溶液梯度洗脱,分离得到组分COS1、COS2、COS3、COS4、COS5、COS6;同样方法筛选得到高免疫活性组分COS6和低免疫活性组分COS4和COS5;最后,HPLC分离制备高免疫活性组分COS6,得到两单体COS61和COS62,对COS62体外淋巴细胞增殖实验表明其免疫活性最高。 以氨基1~6糖混合标样作为分离对象对甲壳低聚糖HPLC分析的色谱柱选型和流动相选择进行优化,并运用该条件对甲壳低聚糖定量进行了研究。结果表明,甲壳低聚糖在相同的色谱条件下保留时间的对数与聚合度成良好的线性关系,可根据聚合度计算出氨基糖的保留时间值或根据保留时间值计算出氨基糖的聚合度;甲壳低聚糖在相同的色谱条件下聚合度与相对定量校正因子的负对数呈现极好的线性关系,可通过测得基准物单糖的定量校正因子来计算其它的低聚糖的定量校正因子。该定性定量方法经样品COS6分析验证可靠性极好。因此在没有标样或只有廉价标样-单糖的情况下可准确快速


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