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己烷雌酚抗体的制备与ELISA方法的建立

王丽英  
【摘要】: 动物性食品的安全问题已成为社会各界极为关注的食品安全热点问题。己烷雌酚残留因为其潜在的致癌性以及其它不良作用对人类的健康造成极大的威胁。本论文旨在研究快速检测己烷雌酚(Hexoestrol, HES)的ELISA试剂盒,这对食品安全监督以及技术储备都有重要的意义。 本课题首先对HES进行衍生化,然后用混合酸酐法分别与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)以及辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)交联,制备成免疫抗原HES-BSA、包被抗原HES-OVA和酶标抗原HES-HRP。通过紫外分光光度法鉴定其合成并估算HES-BSA和HES-OVA的交联率分别为17.9和13.2。用免疫原HES-BSA免疫新西兰白兔制备抗血清,产生的抗血清效价最高达到16000。然后以此抗体为基础设计了间接竞争ELISA方法以及直接竞争ELISA法,并优化了包被时间、pH、竞争时间等实验条件。优化后的间接法和直接法的检测限分别达到0.05ng/mL和0.04ng/mL, 50%的抑制率(50% inhibitory concentration,IC50)分别为0.67ng/mL和0.53ng/mL。直接法总耗时只需大约1.6h,间接法则需要4.65h。用己烯雌酚、双烯雌酚以及激素类药物19-去甲基睾酮、孕酮、睾酮、雌酮来检测此方法的特异性,除了己烯雌酚以及双烯雌酚的交叉率较高之外(间接法中分别为25%和6%,直接法分别为0.5%和0.3%),其余的均小于0.1%。对猪肉、牛肉、鱼肉作了1ng/g和5ng/g水平的添加回收实验,两种方法的回收率分别为68-108%和35-102%,变异系数(Coefficient of variation, C.V.)均在16%以下。采用与仪器分析相比较的方法来对方法进行准确性研究,结果较为一致。本文还对试剂盒的稳定性进行了研究,间接法中低温3个月以及37℃保存6天的实验验证了试剂盒的稳定性。直接法中,试剂盒在一个月的冷藏中也较为稳定。综合各因素,本论文研究的ELISA方法各项参数都达到了检测的需要,可用于实际检测。


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