黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶及制备魔芋低聚糖研究

【摘要】： β-甘露聚糖酶[β-1,4-D-mannan mannanohydrolase, EC 3.2.1.78]是一种能水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主链β-1,4-D-甘露吡喃糖苷键的半纤维素酶,主要来自于微生物。它是一种有一定应用前景的新型工业用酶,目前存在发酵酶活性偏低的缺陷,导致其生产和应用成本高,限制了该酶的广泛应用。本论文较系统研究了发酵培养基组成和发酵条件对黑曲霉Aspergillus niger LW-1固态发酵产酶的影响,大幅度提高了发酵酶活性,同时对酶性质和酶法水解工艺进行了研究,为指导酶的工业化生产和应用以及进一步的分子生物学研究奠定了基础。 通过单因素试验、Plackett-Burman实验和响应面分析法,确定了黑曲霉Aspergillus niger LW-1菌株锥形瓶固态发酵的最佳产酶培养基组成。为麸皮:豆饼粉= 7.5:2.5(g/g),其它物质相对于固体物料的质量分数分别为魔芋粉4%,KH2PO40.3%,玉米浆5%,CaCl2 0.1%,MgSO40.1%,(NH4)2SO4 1%,液固比为1.5:1。通过发酵条件优化得到了该菌株的最优培养条件,即培养基起始pH自然,培养温度32℃,静置培养84h。在上述最优条件下,该菌株产酸性β-甘露聚糖酶的最高酶活达24879 IU/g干曲,比未优化前发酵酶活提高了2.27倍,是迄今为止所有报道中酶活水平最高的。 通过曲盘(大小φ20 cm×4 cm)固态发酵扩大培养试验,获得了酸性β-甘露聚糖酶固态发酵的最优工艺,即培养基最初料水比为1:1.8,起始pH自然,接种量10%(相对于干物料),曲盘中装料150g(以干料计),分别于发酵28h、45h补水和翻曲,32℃培养72 h。在该条件下最高发酵酶活可达22250 IU/g干曲。 采用磷酸缓冲液浸提、硫酸铵分部盐析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析——阶段洗脱、Sephadex G-75凝胶过滤层析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析以及Phenyl-Sepharose CL-4B疏水层析——梯度洗脱的手段方法,从黑曲霉Aspergillus niger LW-1固态发酵曲中分离到相对分子质量和疏水性质非常相近的A、B两种β-甘露聚糖酶组分,其中组分B所占酶活比例较大。纯化酶的回收率为14.3%,纯化倍数为38.6。采用SDS-PAGE电泳和HPLC两种不同方法对纯化的主要组分B进行鉴定,表明其为一种纯酶组分。 运用Sephadex G-75凝胶过滤层析和SDS-PAGE电泳测得纯化酶的相对分子质量分别为41000和40000,两种方法测定结果基本一致,表明该酶以单体形式存在;IEF-PAGE测得该酶的等电点为4.3,苯酚-硫酸法测得该酶含糖量为21.7%;氨基酸含量测定显示,纯化酶中含量较高的前五种氨基酸分别为Asp、Gly、Ser、Glu和Thr,含有较多酸性氨基酸,为酸性蛋白。 对纯化酶酶学性质研究显示,该酶最适反应温度为70℃,60℃以下稳定;在测试的三个温度范围内,纯化酶最适反应pH值均为3.5,表明该酶为酸性酶,该酶在pH3.5~8范围稳定。Zn~(2+)、Ca~(2+)、EDTA对酶有明显的激活作用,Mn~(2+)对酶有较强的抑制作用,Fe~(2+)、Pb~(2+)、Sn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Al~(3+)、Ag~+对酶的抑制作用较弱;其它金属离子对酶活影响不大。以上性质与粗酶试验结果基本一致。纯化酶对槐豆胶半乳甘露聚糖和魔芋葡甘露聚糖的Km值分别为5.1 mg/ml和1.4 mg/ml,对两种多糖的Vmax值分别为1429μmol·min~(-1)·mg~(-1)和625μmol·min~(-1)·mg~(-1),表明魔芋粉与酶的亲和力大些。 采用HPLC法和HPLC-MS法对纯化酶水解槐豆胶半乳甘露聚糖的产物进行定性和定量分析,发现产物除少量单糖甘露糖外,主要含有甘露二糖、甘露三糖,其二糖、三糖、四糖三类寡糖占总水解产物的49.75%。该结果与众多文献报道的相似,表明该酶为内切β-甘露聚糖酶。 以魔芋胶葡甘露聚糖为原料,采用黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶粗酶液进行酶法水解条件的研究,得到的优化工艺条件为:魔芋胶(水溶液)浓度150 g/L,加酶量50 IU/g魔芋胶,50℃水解6 h。所获酶解产物经薄板层析和HPLC检测表明主要为低聚糖以及少量单糖。利用酵母发酵法去除其中的可发酵性单糖,可以大大提高酶解产物中魔芋葡甘露低聚糖的含量。 本研究试验成功了一种新的魔芋胶酶解工艺,突破了魔芋胶粘度大所带来的屏障,解决了甘露低聚糖生产工艺中最关键的问题,即将魔芋胶浓度从10~30 g/L提高至150 g/L,使工业化规模酶解魔芋胶生产甘露低聚糖成为可能。该魔芋甘露低聚糖的生产工艺尚未见报道。