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里氏木霉纤维素酶的液态深层发酵生产及其应用的研究

杨晓辉  
【摘要】: 随着能源危机的加剧,天然纤维质原料酶解生产燃料酒精成为当前研究的热点,然而,纤维素酶的使用成本是束缚此项研究的瓶颈所在。本实验旨在通过优化里氏木霉突变株WX-112液态发酵产纤维素酶的培养条件,寻求能更好降低纤维素酶使用成本的有效途径。用经过预处理的蔗渣代替微晶纤维素作为主要碳源用于纤维素酶的生产,既解决了环境污染问题,又可有效降低生产成本。 通过机械粉碎、酸水解、碱水解、微波与碱联合处理、活性乳酸菌处理等方法预处理蔗渣后用于里氏木霉液态发酵生产纤维素酶。单因素试验结果显示:浓度为1%(w/v)的NaOH溶液水解蔗渣效果较好。在此基础上,结合微波辐射处理,由正交试验得出了最佳的预处理工艺为:用0.30mol/L的NaOH溶液浸泡蔗渣,在微波功率为160W下处理5min,在此条件下单位能耗的酶活净增值最大,后续发酵结束后,酶活较未经处理的蔗渣发酵后所得酶活有显著提高。其中,滤纸酶活和CMC酶活分别由原来的1.73IU/mL和60.2IU/mL提高到3.54IU/mL和134.8 IU/mL,提高了104.6%和123.4%。 利用葡萄糖阻遏效应筛选抗阻遏的高产菌株。在平板上添加4%的葡萄糖筛选得到的菌株产酶最高,滤纸酶活和CMC酶活分别可达4.3IU/mL和165.0IU/mL左右,比原始菌株的产酶量分别提高了33.5%和31.0%。在此基础上,通过单因素试验和L16(45)的正交试验得到了该菌株摇瓶液态发酵的最佳培养基组成为(g/L):蔗渣30,麸皮25,豆饼粉40,乳清粉10,KH2PO4 2.0,胰蛋白胨3.0,硫酸铵2.0,CaCl2 0.5,MgSO4 0.5;对该菌株摇瓶液态发酵的条件进行了优化,得到的最佳培养条件为:种龄48h,培养基的起始pH5.0~5.5,培养温度26~28℃,接种量10%,装液量25ml/250ml,摇床转速180r/min,培养144h。在此条件下最有利于菌体产酶,β-葡萄糖苷酶活、滤纸酶活和CMC酶活最高可分别达到4.5IU/mL、10.1IU/mL、294.6IU/mL。 对酶学性质进行了研究。β-葡萄糖苷酶活、滤纸酶活及CMC酶活的最适pH值均在5.0左右,滤纸酶活和CMC酶活的最适反应温度为55℃,β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为50℃。当酶液在低于50℃,环境pH在5.0左右时保存可以较好的保持酶活力。Zn2+、Mg2+、Na+、Ca2+、Mn2+等对酶活有一定的激活作用,不同浓度的酒精可以不同程度的抑制酶活,且抑制程度随酒精浓度的升高而增加,随温度的升高而加强。 蔗渣经碱与微波联合处理后纤维素的相对含量提高了11.0%,并且比未处理的蔗渣更易被纤维素酶水解糖化。研究了经过预处理的蔗渣酶解的最佳条件为:纤维素酶用量8-10FPU/mL,底物浓度2%,反应温度55℃,反应体系pH4.8,并适当添加一定浓度的表面活性剂Tween-80,在此条件下,得到的最终糖化率为35%左右。酒精对酶解糖化反应的抑制作用表现为:一方面,随着酒精浓度的升高,抑制作用逐步加强;另一方面,温度越高,酒精的抑制作用也越显著。


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