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马鹿茸血蛋白免疫活性肽的制备及其活性研究

马立芹  
【摘要】: 生物活性肽是指具有生物活性的多肽,在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要的作用,其研究已经成为多肽类药物以及功能性食品的开发热点。酶法水解蛋白质获得活性肽是当前制备活性肽的主要手段。由于单一酶存在水解位点单一、水解不彻底等缺点,采用复合酶解已成为研究的一个重要方向。 本文选用了木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及酸性蛋白酶进行单一酶解,测定了最佳酶解条件下酶解物促脾淋巴细胞增殖的活性和对DPPH·自由基的清除能力,其中木瓜蛋白酶酶解液具有最高的免疫活性。采用双酶复合酶解,得到木瓜蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解,酶解液具有最高的促进淋巴细胞增殖的能力,复合酶解条件为:[E/S]为9000 U/g,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解温度各为50℃和45℃,pH各为7.1和6.8,分别水解2 h和1.5 h。两酶复合酶解物的淋巴细胞增殖率比单酶酶解物增加了20.8%。免疫活性与DPPH·清除能力之间存在显著的相关性(r=0.96,P0.01)。 采用DA201-C大孔吸附树脂对复合酶水解液进行初步分离,氨基酸组成分析表明随着乙醇浓度的升高,疏水性氨基酸含量逐渐增大,75%乙醇洗脱组分具有最高的免疫活性。进一步采用SephadexG-15以及RP-HPLC分离,并确定了较优的分离条件。 最后对具有最高的清除自由基能力的组分进行了体外的免疫学实验以及氨基酸序列测定,实验证明从鹿茸血蛋白酶解液中分离、纯化得到的小肽具有增强机体免疫活性的作用;液质联用分析得到三个主要的组分Leu-Tyr(LY)或者Ile-Tyr(IY),Try-Gln(WQ),Leu(或Ile) -Ala-Phe-Ala(LAFA或IAFA),或者Leu(或Ile)-Ala-Ala-Phe(LAAF或IAAF),表明免疫活性肽的氨基酸组成具有末端为疏水性氨基酸的特点。


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