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钝齿棒杆菌产L-精氨酸供氧策略优化的初步研究

许虹  
【摘要】: L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸,是合成蛋白质肌酸的重要原料,也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物,具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究领域中用途广泛,导致市场对其需求量正不断增加。 溶氧对于好氧发酵生产L-精氨酸来说,既是营养因素,又是环境因素,对菌体的生长和产物的形成都有重要影响。解决氧需求问题通常有两种方法:一是提高发酵过程中的溶氧水平,另一途径则是利用基因工程技术来提高细胞自身对氧气的利用率。本论文即将分别从这两方面优化L-精氨酸发酵的供氧策略。 论文以钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5为研究菌株,通过控制不同供氧条件的试验,考察发酵过程中供氧对L-精氨酸合成的影响。不同供氧条件下的L-精氨酸发酵特性的研究结果表明,发酵生产L-精氨酸对供氧有较高的要求,在发酵过程中需要消耗大量的氧气来维持细胞代谢和L-精氨酸的合成,氧的供应不足会严重抑制L-精氨酸的合成。 对不同供氧条件下该菌株代谢流量分配进行分析后发现:高供氧(HOS)条件下,L-精氨酸的产量得到了提高。但是,在发酵的后半阶段,中供氧(MOS)比高供氧(HOS)更有利于稳定的L-Arg积累。因此,提出了两步法供氧控制策略,该策略先在发酵的初始阶段维持HOS条件,然后控制搅拌转速稳步下降,以维持一个稳定的溶氧改变。运用新的供氧策略后,L-精氨酸的产量达到36.6 g/L,比HOS和MOS分别增加了16%和51%,而且,葡萄糖的消耗速率的明显增加,发酵周期仅为81 h,比HOS条件下提前了6 h。 C. crenatum SYPA5-5是革兰氏阳性工业用菌株,尚未见钝齿棒杆菌的遗传表达体系的研究报道。本论文以氯霉素乙酰转移酶基因(cat)作为报告基因,成功构建了含有不同启动子的重组表达质粒,并对其在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中的启动子活性进行了研究。结果发现,在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中启动子强度最大的都是tac启动子,lacZ次之,T7启动子强度最小,且T7在钝齿棒杆菌中不具有启动子功能。因而,确定下一步实验所用启动子为tac。 在此基础上,成功构建了携带有来源于透明颤菌血红蛋白基因vgb的表达质粒pJC1-tac-vgb,并分别转入大肠杆菌JM109和钝齿棒杆菌SYPA5-5。利用CO差光谱法对重组菌表达的透明颤菌血红蛋白进行了活性及定量检测。并对重组菌SYPA5-5(pJC1-tac-vgb)的发酵特性进行了初步分析。结果显示,发酵过程中不加IPTG的重组菌的菌浓比原始菌提高了10.9%,产酸能力提高了13.0%。


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