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絮凝性酿酒酵母基因工程菌的构建与发酵

王付转  
【摘要】: 本研究的目的是采用遗传改良技术,使酿酒酵母絮凝基因FLO1在发酵性能优良的工业酿酒酵母中表达,得到絮凝重组工业酿酒酵母菌株,以利于在酒精发酵末期利用酵母自身的絮凝沉降能力从醪液中分离细胞,节约酒精生产的能源成本。研究内容如下:把酿酒酵母絮凝基因FLO1接入表达载体pYX212,构建重组质粒pYX-FLO并转化酿酒酵母W303-1A,得到絮凝重组酿酒酵母W303-1A F4;在质粒pYX-FLO中接入筛选标记G418抗性基因kanMX表达盒,构建重组质粒pYX-FLO-kan转化工业酿酒酵母ZWA46,得到絮凝重组工业酿酒酵母ZWA46-F2;利用絮凝重组菌ZWA46-F2进行细胞回用反复分批发酵及连续发酵等生产酒精的工艺研究;以及对絮凝基因FLO1编码产物酵母胞壁蛋白Flo1p进行研究。主要研究结果如下: 1.重组酿酒酵母W303-1A F4的絮凝值达到70 %且絮凝能力传代稳定;在培养基初始pH 2.5-7.0范围内,重组菌W303-1A F4絮凝能力变化不大;重组菌W303-1A F4在细胞生长稳定期前期启动絮凝,其絮凝的启动和葡萄糖耗竭非耦联。实验结果证明可以通过启动子TPI控制絮凝基因FLO1表达的遗传操作方法获得絮凝重组酿酒酵母W303-1A F4,为基因FLO1在工业酿酒酵母中的表达奠定了研究基础。 2.工业酿酒酵母絮凝基因工程菌Ay-F12的絮凝值达到80 %而且具有良好的传代稳定性能。在初始pH 3.5-5.5范围内,其絮凝性能没有明显变化,但对其酒精生产能力有较大的影响。重组菌Ay-F12在细胞生长稳定期前期启动絮凝,其絮凝的启动和葡萄糖耗竭呈非耦联关系。5 L发酵罐实验表明,重组菌Ay-F12和野生菌Angel yeast的发酵过程变化规律基本一致,但前者较后者的发酵周期稍有延迟(6 h)。重组菌Ay-F12的酒精产量最高达到8.1 % (v/v),酒精对葡萄糖的转化率达到其理论转化率的84.5 %。 3.重组菌Ay-F12在30至40℃的温度条件下,能保持较好的酒精发酵能力。在30-50℃温度范围内,菌体细胞的絮凝能力基本一致。重组菌Ay-F12在较高温度条件下,既能保持较好的酒精发酵性能,又具有良好的絮凝能力。 4.絮凝重组工业酿酒酵母ZWA46-F2的絮凝能力达到95 %且絮凝传代稳定;在培养基初始pH 2.5-6.0范围内,重组菌ZWA46-F2的絮凝性能没有明显变化,但对其酒精生产能力有较大的影响;重组菌ZWA46-F2在细胞生长稳定期前期启动絮凝,其絮凝的启动和葡萄糖耗竭呈非耦联关系;在30-50℃温度范围内,菌体细胞的絮凝能力基本一致。 5. 5 L发酵罐实验表明,重组菌ZWA46-F2和野生菌ZWA46的葡萄糖消耗、生物量、pH值和酒精浓度等过程参数的变化规律基本一致,但前者较后者的发酵周期稍有延迟(3 h)。重组菌ZWA46-F2的酒精产量最高达到8.6 % (v/v),乙醇对葡萄糖的转化率达到其理论转化率的89.8 %,和野生菌株相同。 6.絮凝重组工业酿酒酵母ZWA46-F2的细胞回用反复分批发酵共进行了26批次,结果表明,第6批次的发酵强度达到最大值2.27 g/l h,比第一批次普通分批发酵提高了78.7 %。酒精浓度在第11和12批次时达到最大值9.0 % (v/v),此时糖转化率为0.50 g/g。当细胞回用至22批次时,发酵强度为1.26 g/l h,和第一批次相当,随后逐渐下降,因此,重组菌ZWA46-F2反复分批发酵的细胞回用次数以22批次为宜。 7.利用絮凝重组工业酿酒酵母ZWA46-F2进行连续发酵,发酵强度最大值达到3.82 g/l h;重组菌ZWA46-F2单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵,即把重组菌经5批细胞回用反复分批发酵后再进行单级连续发酵,发酵强度进一步得到提高,最大值达到5.82 g/l h。 8.四种发酵工艺的结果表明,单级连续发酵的酒精发酵强度是普通分批发酵的3倍,单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵的发酵强度是细胞回用反复分批发酵的2.6倍,说明酒精生产的连续发酵工艺明显优于分批发酵。且单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵的发酵强度比单级连续发酵提高了52.4 %,表明利用单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵的工艺,可以达到高产率和高得率的酒精生产目标。 9.分离纯化得到絮凝重组酿酒酵母W303-1A F4的胞壁蛋白Flo1p,并进行Western blot分析,表明絮凝蛋白Flo1p分子量大小约200 kDa左右;考察了来自S. cerevisiae W303-1A的絮凝蛋白Flo1p的特征,该蛋白活性受甘露糖抑制,而不受葡萄糖、麦芽糖、蔗糖及半乳糖抑制,实验表明,S. cerevisiae W303-1A的胞壁絮凝蛋白Flo1p属于典型的Flo1型。胞壁絮凝蛋白Flo1p N端活性区域研究表明,第196至209个氨基酸是Flo1p结合甘露糖的活性区域;第210至240个氨基酸,不是该蛋白与甘露糖结合的活性区域,但是该区域对絮凝蛋白Flo1p与甘露糖结合的活性有一定影响。


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