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草鱼消化系统蛋白酶生化特性的研究

刘忠义  
【摘要】: 酶、不饱和脂肪酸以及抗冷冻蛋白是水生生物体内适应变温环境的几种重要的功能物质。酶是鱼以及水生生物体内非常重要的功能物质,具有比较典型的生长环境温度适应性。来源于低温寒冷地区的鱼及其他水生生物体内的酶具有冷酶的某些性质,在低温下有比较高的催化活性,能有效催化生物化学反应;对热不稳定,在中等以上温度即迅速失活;有比较低的Arrhenius活化能。而在热带地区的鱼体内发现有耐热的消化蛋白酶。已经研究的大多数来自鱼虾等水生生物体内的消化蛋白酶表现出一定的不是很严格的冷酶的特性。 本论文选择我国主要淡水鱼草鱼作为研究对象,研究其消化道蛋白酶的主要生物学特性。主要目的是探讨草鱼消化器官中蛋白酶的可开发利用前景并深入研究探讨草鱼消化生理和营养。 研究了草鱼和青鱼主要消化酶的活性分布。在草鱼和青鱼各消化器官中均检出酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、淀粉酶和三酰基甘油脂酶的活性。上述主要消化酶在2种鱼的消化器官中有各自不同的分布。这些酶在2种鱼的肝和胰腺中活性比肠道高得多。这些消化酶大多沿青鱼和草鱼的整个肠道分布。除青鱼肠道中的淀粉酶外,所有其他酶在2种鱼的肠中、前段的活性均高于肠道尾部的活性(酸性蛋白酶在青鱼尾肠段中的活性尤其低),但是2种鱼尾肠段的酶活性也相当高,尤其是草鱼。青鱼肠道中消化酶活性的分布更复杂些,每种酶都有不同的分布规律。和青鱼相比,这些酶在草鱼肠道中的分布更均匀一些。碱性蛋白酶在草鱼肠道中前部的活性只略高于尾段。整个肠道表现出的高碱性蛋白酶活性可能是草鱼快速生长的原因之一。 研究了草鱼消化道中粗酸性和碱性蛋白酶的提取及部分性质。粗酶的热稳定性研究表明粗草鱼酸性蛋白酶在50℃保温30 min后损失其80%的酶活力,而使粗草鱼碱性蛋白酶损失约80%的酶活力需要60℃保温30 min。粗草鱼碱性蛋白酶的热稳定性表现出某种生长环境适应性的趋势。 采用SDS-底物-PAGE电泳方法并经适当改进,分析鉴定了草鱼肠道粗碱性蛋白酶的种类。草鱼肠道中只有胰蛋白酶和金属蛋白酶,没有胰凝乳蛋白酶,这种简单的酶谱可能更加有效,尤其是在很强的环境适应能力和独特的食性方面。 通过凝胶过滤色谱和离子交换色谱纯化了2种草鱼肠道胰蛋白酶(胰蛋白酶同工酶GT-A和GT-B)。纯化的酶在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片上以单带迁移,其相对分子质量分别为26,400和30,750。高效液相表明2种酶是纯纯酶。GT-A和GT-B均能水解酪蛋白和BAEE(N-苯酰-1-精氨酸乙酯),被SBTI(大豆胰蛋白酶抑制因子)、PMSF(甲苯磺酰氟)和TLCK(甲苯磺酰赖氨酸氯甲酮)等强烈抑制,不被EDTA(乙二胺四乙酸二钠)抑制,依据其分子质量、水解特性和抑制特性,判断这是2种胰蛋白酶。 研究了2种纯化的胰蛋白酶的各种性质。GT-A的最适作用pH为8.0,GT-B为8.5。GT-A的最适作用温度为40℃,GT-B为45℃。GT-B的热稳定性略高于GT-A,在中性磷酸盐缓冲溶液中,2种酶都在加热温度达到65℃时迅速失去活性,其热稳定性高于极地或者长期生长在寒冷环境里的鱼胰蛋白酶而低于热带鱼胰蛋白酶,这是草鱼生长环境温度适应性的表现之一。草鱼胰蛋白酶有高的生理转化效率V_(max)/K_m,有低的Arrhenius活化能值(E_a)。氯化钙的存在基本上不影响酶的活性,但是提高酶的热稳定性。DSC(差示量热扫描分析)表明酶的热变性温度分别为66.3℃(GT-A)和67.3℃(GT-B)。钙离子的存在分别提高2种酶的变性温度6.7℃(GT-A)和7.1℃(GT-B)。草鱼胰蛋白酶的热稳定性介于北极鱼和热带鱼胰蛋白酶之间,这和中国大部分省内草鱼生长的广泛的水域环境温度相适应。 研究了2种草鱼胰蛋白酶同工酶的氨基酸组成以及圆二色性。2种酶都只含有比较低的芳香族氨基酸、半胱氨酸以及蛋氨酸,丝氨酸和甘氨酸的含量很高,尤其酸性氨基酸含量极高,而碱性氨基酸含量相对比较低。酶溶液在280 nm处只有微弱的吸光度,而在210 nm附近有很高的吸光度。在变性剂存在下,GT-B的紫外吸收大幅度增加,依据“双状态模型”计算得到其变性自由能为39.825KJ/mol。CD测定表明2种酶蛋白分子均具有较少的规则二级构象单元(包括α-螺旋、β-折叠以及β-转角)和较多的无规卷曲构象。这些信息结合起来可以较好地解释2种酶的理化和动力学等性质。此外,2种酶的活性中心肯定含有丝氨酸和组氨酸残基。 此外,结合底物特异性以及底物-PAGE分析了草鱼肠道的酸性蛋白酶的活性组分。草鱼肠道酸性蛋白酶中有1种组织蛋白酶B、L或者H,另外有1种酶能水解牛血红蛋白而不能水解BAA(N-苯酰-1-精氨酰苯胺)。部分纯化了从草鱼肠道中提取的粗酸性蛋白酶,其主要活性组分是一种能水解牛血红蛋白而不能水解BAA的酶。部分纯化的酶最适作用温度为37℃,最适作用pH约为2.3,酶不耐热,60℃加热30min即丧失几乎全部活力。酶被胃抑酶素A强烈抑制,被EDTA抑制,但是不被PMSF和SBTI抑制。


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