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共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的研究

刘芳  
【摘要】: 共固定化酶是近年来兴起的一项新技术,具有发挥多种酶的协同作用,能够实现底物到产物的一步转化等诸多优点,因此受到越来越广泛的关注和研究。目前,国内外有关乳糖酶和葡萄糖异构酶的共固定化及其在乳果糖制备中的研究尚未见报道。本文分别选用明胶和多孔玻璃为载体制备共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶,旨在将其应用于乳果糖的酶法生产,为乳果糖的制备提供一条新的途径。 研究和建立了乳果糖的快速测定方法:薄层层析法(TLC)。确立了最佳的薄层铺板调浆剂为硅胶G+0.05%羧甲基纤维素钠+0.1 mol/L磷酸二氢钠,展开剂为正丁醇:乙醇:水=5:3:2(体积比),显色剂为苯胺-二苯胺-磷酸溶液,薄层扫描仪的波长为526 nm。结果表明用薄层层析-薄层扫描法测定乳果糖,精密度和稳定性较好,回收率符合要求,能够满足一般检测的需要,可以作为乳果糖大批量半定量检测的有效方法。采用HPLC法分析了反应产物,发现HPLC和TLC相比灵敏度、精密度更高,准确性相当,但检测时间相对较长、成本较高。 对比了开孔明胶、卡拉胶和明胶,选择明胶为固定化载体,通过先包埋再交联的方法共固定乳糖酶和葡萄糖异构酶。以固定化酶的活力回收率为指标,研究确定了最佳的固定化条件为:pH 8.6,明胶的质量浓度为23%,前交联戊二醛的体积分数为0.15%,后交联戊二醛的体积分数为0.15%,后交联温度4℃,后交联时间10 min。此时乳糖酶和葡萄糖异构酶的活力回收率分别为32.05%和82.52%。 采用溶胶-凝胶法制备多孔玻璃载体,先用HCl调节溶胶溶液的pH至3,然后在60℃下脱水,即可制得透明的凝胶。此法工艺简单,所制得的多孔玻璃大小较为均匀。以所制多孔玻璃为载体,采用共价结合法共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶。以酶活回收率为指标,确定了最佳的固定化条件:载体在甲苯和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液中110℃回流3 h进行烷基化,再在体积分数0.5%的戊二醛中活化。固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶的活力回收率分别为20.13%和13.93%。 研究了两种共固定化乳糖酶和葡萄糖异构酶用于乳果糖制备的部分酶学性质。以明胶为载体的共固定化酶的最适温度为45℃,最适pH为7.5,重复使用6次后,酶活仍保持在初始活力的80%以上。此法制备条件温和,所得共固定化酶活力回收率较高。以多孔玻璃为载体的共固定化酶的最适温度为45℃,最适pH为7.5,热稳定性、pH稳定性良好,重复操作10次后,酶活仍保持初始活力的70%以上。所以,多孔玻璃法制备的共固定化酶尽管活力回收率较低,但稳定性较好,机械强度高,可以重复多次回收使用,具有良好的经济效益。以40%乳糖为底物,在pH 7.5、45℃的条件下反应24 h,分别用明胶包埋法和多孔玻璃共价结合法制备的共固定化酶催化反应,产品中乳果糖的产量分别为36.50 mg/mL和45.59 mg/mL。


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