竹黄菌发酵产竹红菌素的研究

【摘要】： 竹黄是我国民间药用真菌,其主要生物活性成分为竹红菌素。本文筛选到一株产竹红菌素的竹黄菌株并对其进行了鉴定,然后围绕其色素组成成分鉴定、固态发酵产色素条件和产色素的生理特征展开了研究,得到了如下主要结果: 1)采用PDA平板筛选到一株产竹红菌素的竹黄菌株,命名为SUPER-H168。通过分子生物学鉴定,确认该菌株隶属于竹黄属(Shiraia)。rDNA聚类分析表明,该菌株与GenBank中已经提交的竹黄菌(Shiraia bambusicola)序列相似度分别为91%(18S rDNA)和88%(ITS-5.8S rDNA)。在无性世代的菌丝上发现了较小的分生孢子器(3～5μm×10～20μm)和分生孢子(一般1μm),之前的文献中未曾有报道。对发酵菌丝的组成成分研究表明,其营养组分与子座差异较大,但竹红菌素含量接近。 2)利用制备反相高效液相色谱法,对竹黄菌株SUPER-H168固态条件下所产的色素进行了分离,发现固态发酵条件下所获得的色素有6个主要组分,采用NMR(1H NMR及13C NMR)及质谱法对其中的4种组分进行了鉴定。结果表明,这4种组分分别为竹红菌甲素(HA)、竹红菌乙素(HB)、竹红菌丙素(HC)和痂囊腔菌素C(EC)。其中EC为首次从竹黄中分离到。 3)竹黄菌株SUPER-H168生长需要较充足的营养条件,在营养贫乏的固态基质(如米糠、甘蔗渣、锯末、竹屑、秸秆、橘皮和玉米芯等)上几乎不生长。色素产生需要合适的基质,主要是淀粉含量高的一些谷物(如大米、小米、小麦、黑米、玉米、高粱和荞麦等)及某些副产品(如麸皮)。利用大豆及豆粕作为基质时,菌体生长良好,但无色素生成。色素的产生与基质的淀粉/蛋白比值(S/P)有很大关系,只有当S/P大于1.4时才会产生色素。此外,色素各组分百分含量还受到发酵基质的影响,其中HA是色素的主要组分(通常超过40%),以小米和高粱为基质时菌株不产HB。研究表明,发酵基质中淀粉酶活力和蛋白酶活力均比较低。淀粉酶活力和还原糖含量变化非常一致,在一定时间内可以反映菌体量的变化。但两种酶与菌体产色素无直接关系。 4)以玉米渣作为固态发酵基质,采用250 mL三角瓶进行固态发酵实验。首先通过单因素法对固态基质产色素条件进行了初步优化,然后通过响应面设计对培养基进一步优化,最后获得的优化培养基为:玉米渣(粒径1.0～1.2 mm)25 g、麸皮5 g、初始含水量50%、初始pH 7.0,NaNO3 0.261 g、ZnSO4·7H2O 0.054 g、葡萄糖1.5 g,培养温度30℃,相对湿度为80%～90%,发酵周期18 d。在此条件下色素产量为14.08 mg/g干基,约为优化前的2倍。实验还发现氮源的种类和添加量对色素的产生有着极为明显的影响。在一定范围内,无机氮源中的NaNO3及有机氮源中的牛肉膏、酵母膏有利于色素的产生,而无机氮源中的尿素和某些铵盐((NH4)2SO4、NH4Cl和NH4NO3等)及有机氮源中蛋白胨对色素的合成具有强烈抑制作用。金属离子对色素的合成也有一定影响:Zn2+、Na+及K+利于色素产生,Mn2+则有抑制作用。根据固态发酵过程数据,构建了菌体生长、色素合成和底物(残糖)消耗动力学模型。 5)采用液态发酵的方法,对菌体产色素过程中的生理特征进行了研究,发现菌体在产色素时氧化水平较高(丙二醛含量升高),这表明菌体在产色素时受到了色素的氧化胁迫作用。总抗氧化力变化比较小,说明菌体启动了抗氧化机制维持了胞内及胞外氧化/还原水平的平衡。研究发现,在发酵24 h左右加入终浓度40μmol/L的过氧化氢可以促进色素的产生,一定强度的光照(40μE/m2/s)也可以促进平板培养和液态发酵条件下色素的合成。上述结果说明色素对菌体的氧化胁迫作用可促进色素的分泌,属于一种正反馈机制。