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纤维蛋白溶解酶的发酵制备、分离纯化及酶学性质研究

华颖  
【摘要】: 微生物种类繁多、分布广泛,从自然界中筛选纤维蛋白溶解酶产生菌,进一步开发高效、特异、安全、廉价的新型溶栓药物具有巨大的社会价值和经济价值。本文从虾酱中分离、筛选出一株纤维蛋白溶解酶产生菌,经纤维蛋白平板检测,表现较强的溶栓效果,并对其进行生理生化性质鉴定,结合16S rDNA序列分析,经中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)鉴定为芽孢杆菌,定命名为Bacillus sp. nov. SK006 (CCTCC NO.: M 205071)。 本文在摇瓶水平上对该菌发酵产酶的培养基组成进行了优化,并当以葡萄糖为碳源,浓度为2%,胰蛋白胨为氮源,浓度为3%,Na2HPO4·12H2O 1.5%、NaH2PO4·2H2O 0.13%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl2 0.01%,初始pH 7.0,种龄为18 h,装液量为50 mL/250 mL,接种量为3%,37°C、180 r/min。 进一步使用5 L全自动发酵罐对发酵过程的温度、pH和通气量变化对产酶的影响进行了研究,确定了阶段变温策略:0-36 h控制在37oC培养,36 h后至发酵过程结束控制在30oC;阶段调整通气量策略:在菌体的对数生长期,适当加大通气量有利于细胞的积累从而提高酶的产量。 在5 L发酵罐研究结果的基础上,构建BP神经网络模型来模拟Bacillus sp. nov. SK006发酵生产纤维蛋白溶解酶过程,对发酵过程的生物量和纤维蛋白溶解酶的产量进行初步拟合、预测,结果表明,BP网络模型对纤维蛋白溶解酶的预测非常具有参考价值。 通过Native-PAGE对Bacillus sp. nov. SK006发酵液进行初步活性鉴定,发现发酵液中含有多种具有纤溶活性的同工酶,通过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析等一系列分离纯化手段,将其中两种主要的纤维蛋白溶解酶(SPFE-1与SPFE-2)纯化至电泳纯,并结合SDS-PAGE和凝胶过滤对酶的纯度和分子量进行鉴定,分析结果表明,这两种纤维蛋白溶解酶均为单体酶,分子量分别为46.0 kDa和12.3 kDa。 SPFE-1在50°C以下相对稳定,在30-40oC保温4 h,相对酶活仍在60%左右,在50°C保温2 h,也能保持60%以上的酶活,而SPFE-2稳定性稍差,但在40oC以下保温2 h仍然保持较高的活力,总的说来,SPFE-1和SPFE-2具有较好的耐热性。 SPFE-1与SPFE-2在比较宽的pH范围内都保持稳定,尤其SPFE-2在pH4.0-8.0的范围内稳定性较强。 金属离子和酶抑制剂对酶活的影响研究表明:Mg2+和Co2+对SPFE-1几乎没有影响,而Zn2+能增强酶活力,EDTA、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+和Hg2+则分别对酶产生了不同程度的抑制作用,其中以Cu2+,Hg2+抑制作用最为强烈;PMSF和PCMB对SPFE-1的酶活也表现出较为强烈的抑制作用,推测SPFE-1是一种丝氨酸蛋白酶,且活性中心存在半胱氨酸基团。对于SPFE-2来说,Cu2+和Ca2+促进酶活,而Zn2+却抑制酶活。2-mercaptoethanol对酶活也有抑制作用,推测Zn2+与SPFE-2活性中心催化部位的-S-S-结合,改变了酶的催化能力。低浓度的EDTA即可完全抑制SPFE-2,说明SPFE-2可能是一种金属蛋白酶。 SPFE-1与SPFE-2对底物具有高度专一性,它们的最适底物为N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA,该底物是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)或胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的最适底物,也是纳豆激酶的最适底物。采用Hanes-Woolf法作图法,求得它们作用最佳底物的特征常数分别为Km:0.60/0.51 mmol/L;kcat:712.93/154.25 s-1;kcat/Km:1.19×106/3.02×105 L·s-1 mol-1 (SPFE-1/SPFE-2)。 SPFE-1与SPFE-2都既可以直接降解纤维蛋白,还对纤维蛋白溶解酶原有激活作用,从而间接降解纤维蛋白。 在对纤维蛋白原的降解过程中,SPFE-1最先降解纤维蛋白原的β链,然后是α链,很难降解γ链,而SPFE-2顺次降解α、β和γ链。 SPFE-1与SPFE-2的N-端氨基酸序列的前13个残基相同,依次为:AQSVPYEQPHLSQ,虽然与几种芽孢杆菌来源的纤维蛋白溶解酶有一定程度的同源性,但不完全相同于现已发现的纤维蛋白溶解酶。 圆二色性分析表明,SPFE-2中β-折叠与回转结构为0,而SPFE-1中存在较大比例的更稳定的β-折叠。


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