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L-精氨酸产生菌的选育及其代谢调控的初步研究

殷树昌  
【摘要】: 本论文以代谢控制发酵原理为理论基础,以本实验室保藏的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ZGH-064为出发菌株,系统地研究了L-精氨酸产生菌的选育、摇瓶发酵条件以及代谢流量分析等,主要研究内容和结果如下: ⑴以ZGH-064为出发菌株,经紫外线、硫酸二乙酯和亚硝基胍逐级诱变处理,用磺胺胍(SG)、L-高精氨酸(L-HA)抗性平板以及琥珀酸(Suc)为唯一碳源的筛选平板定向筛选,成功选育出一株L-精氨酸产量较出发菌株有较大提高的菌株YHR-109(SGR, Sucg, L-HAR)。在未经优化的条件下可积累L-精氨酸15.5g/L。 ⑵通过对种子培养基正交实验分析,优化确定了菌株YHR-109合成L-精氨酸的最佳种子培养基组成(g/L):葡萄糖25,(NH4)2SO4 15,玉米浆25,KH2PO4 1,MgSO4·7H2O 0.5,CaCO3 20;种子最佳培养条件:pH7.0,同时确定装液量25mL/250mL。 ⑶在研究影响YHR-09产酸的葡萄糖、硫酸铵、玉米浆和生物素4个单因素实验的基础上,用Design Expert软件的Central Composite Design建立响应曲面模型优化发酵培养基。从而确定了发酵培养基最佳配方为(g/L):葡萄糖110.0,玉米浆23.7,(NH4)2SO4 48.0,KH2PO4 1.5,MgSO4·7H2O 0.5,生物素80μg/L,CaCO3 30。在此培养条件下,采用250 mL摇瓶装液15mL,往复式摇床30±1℃培养,摇床转速为100r/min,发酵96h,产酸水平可稳定在21.0g/L,比未经优化情况下产酸量提高了约35.4%。通过发酵对比实验可见,培养基营养条件的改善是L-精氨酸产量显著上升的主要因素。 ⑷以代谢流量分析理论和L-精氨酸生物合成的代谢机制为基础,构建了L-精氨酸生物合成的网络模型。根据胞内外代谢产物的质量平衡利用Matlab软件计算出了菌株YHR-109生物合成L-精氨酸的代谢流分布并对影响L-精氨酸合成的主要节点丙酮酸和谷氨酸处的流量进行了分析。结果表明,草酰乙酸回补途径的磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应的流量较小(只有11.65),这可能是造成L-精氨酸合成流量较小(只有9.15)的重要原因。在接下来的育种实践中,可考虑选育强化CO2固定反应的菌株。此外,由于L-谷氨酸是很多氨基酸生物合成中氨基的供体,其他氨基酸的合成,造成了α-酮戊二酸与L-谷氨酸间的大量的“无效”代谢流循环。由此可见,进一步提高菌株YHR-109的L-精氨酸结构类似物抗性水平对增大L-精氨酸有效代谢流通量并减少杂酸的合成很有意义。


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