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抗黄曲霉毒素B_1的单链抗体的筛选、表达和改造

杨炼  
【摘要】: 黄曲霉毒素是一类真菌次级代谢产物,有强烈致癌性,其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是致癌能力最强的一种。食品和饲料中的黄曲霉毒素污染对人民群众的健康造成了极大伤害,每年造成了上亿美元的损失。因此世界各国都对食品和饲料中黄曲霉毒素的限量做了严格规定。目前检测黄曲霉毒素的方法主要是色谱学方法和免疫学方法,其中免疫学方法简单快速,特异性强,预处理简单,越来越广泛地被应用到黄曲霉毒素的检测中。高质量的抗体是免疫学方法的核心。重组抗体技术是继多克隆抗体制备技术和单克隆抗体制备技术之后第三代抗体制备技术。人们在重组抗体的筛选、表达和改造方面投入了很多研究工作。 本研究旨在建立高特异性的抗AFB1的单链抗体筛选方法,选择合适的系统表达筛选到的抗体基因,采用同源建模的方法建立该单链抗体的模型并进行了分子对接,以此为依据进行了亲和力和稳定性改造。 在筛选过程中,AFB1被直接包被到Maxisorp酶标板上,并用该板对Tomlinson I+J文库进行筛选,这避免了以往筛选研究中半抗原-载体复合物对半抗原表位的破坏和载体上占主导地位的表位对筛选的误导。在洗脱过程中,采用竞争洗脱与胰蛋白酶处理联用洗脱的方法可以极大地提高洗脱结果中目标抗体的比例。三轮筛选后随机挑取的46个克隆中有44个阳性克隆,这个比例远高于以前的报道。获得的一个有较高亲和力的抗体克隆H4,经测定其AFB1的半抑制浓度(IC50)为0.4 ng/mL,亲和力为1.2×10-12 L/mol。scFv-H4与AFB2、AFG1和AFG2的交叉反应性分别为12%, 42%和9%。我们首次报道了抗黄曲霉毒素单链抗体的序列。另外聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)也首次用于研究抗体文库的筛选过程,PCR-DGGE可更直接反应筛选过程中克隆的富集情况和筛选结果的多样性和丰度。 将scFv-H4的基因克隆到pET载体上,在pET表达系统中表达。比较了四种表达载体pET20b,pET22b,pET28a和pET32a对scFv-H4的表达效果后,发现pET20b和pET22b能够表达有生物活性的蛋白,pET28a不能用来表达scFv-H4,而pET32a表达的scFv-H4只能以包涵体的形式存在。pET22b的T7lac启动子可以严谨地控制scFv-H4的本底表达,有利于宿主自身生长,诱导结束时有生物活性的scFv-H4量也较高。有生物活性的scFv-H4主要存在于细胞周质中,而细胞质内的scFv-H4以包涵体的形式存在。诱导物浓度对scFv-H4表达影响不大,温度对scFv-H4总表达量和包涵体的形成有明显影响,20oC是较适宜的诱导温度,能表达较多有生物活性的scFv-H4,减少包涵体的形成。 根据scFv-H4的氨基酸序列,用WAM服务器建立了其空间模型。二面角分析认为该模型基本合理,另外相对可及面积,相对残基体积,空间/填充质量指数,三维轮廓质量指数都处于合理范围。参照scFv-H4与AFB1-BSA,AFB2、AFG1、AFG2的交叉反应性,用Patchdock服务器对scFv-H4和AFB1进行硬对接后用Firedock服务器对侧链的定向和构象进行优化,获得了10个能量最低的对接方案。用Ligplot软件分析scFv-H4与AFB1的相互作用以疏水相互作用为主,同时也分析他们的范德华引力,范德华斥力,原子接触能和氢键。 基于TomlinsonI+J文库序列多样性分析和分子scFv-H4与AFB1的对接模型,在H50、H52、H52a、H53、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94和L96个18氨基酸位点采用NNK形式进行饱和突变,并进行亲和筛选,结果表明CDR H2和CDR L2不参与scFv-H4对AFB1的识别。CDR L3中的AL91是一个关键性的结合位点,HH95对抗原-抗体的识别也有重要影响。用CDR步移法获得的一个亲和力提高的克隆A10,scFv-A10对AFB1的IC50为0.12 ng/mL。我们还采用结构域间二硫键来提高scFv-H4的稳定性,比较了一些引入二硫键的候选位点后,确定H44-L100是较好的位点。经过定点突变后,含有H44-L100结构域间二硫键的dscFv-H4对盐酸胍的耐受性提高,蛋白聚集现象明显减少;亲和力保持不变。


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