乳酸菌黏附派伊尔结及免疫调节作用研究

【摘要】： 派伊尔结(Peyer’s patch,PP)是肠道黏膜免疫系统的重要部位,是乳酸菌进入肠黏膜免疫诱导部位的主要通道。本课题研究乳酸菌表面性质和黏附黏液、PP性能的关系,不同黏附性能的乳酸菌和强黏附菌株(三种状态:活、紫外灭活和热灭活)的免疫调节作用,强黏附菌株的抗感染作用和调节PP基因表达的作用。这些研究有助于阐明乳酸菌调节黏膜免疫机制,也将为乳酸菌免疫调节制剂的开发提供理论依据。 试验先用大鼠黏液、小鼠PP为黏附基质,研究23株细菌的黏附性,结果显示,Lactobacillus plantarum Fn008、Lactobacillus acidophilus Fn037、Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)和Salmonella Typhimurium为强黏附菌株。利用细菌黏附正十六烷、水接触角法测定细菌表面疏水性,结果表明,23株细菌的表面疏水性与黏附性没有相关性。利用红细胞凝集试验分析乳酸菌细胞表面凝集素的表达情况,结果表明23株的细菌凝集性与其黏附性没有相关性。利用细菌表面疏水性、表面电荷和液体表面张力计算细菌表面自由能,结果表明22株乳酸菌的表面自由能与其黏附PP性呈负相关。 为了研究乳酸菌黏附PP能力与免疫调节的关系,分别给小鼠连续3天灌胃四株黏附PP能力不同的乳酸菌(LGG、Fn008、Fn022和Fn036)以及Salmonella,检测脾淋巴细胞增殖能力及其基因IL-12表达能力、腹腔和派伊尔结巨噬细胞吞噬能力、细胞因子(IL-4,IL-10,IFN-γ,TGF-β,IL-17)、黏膜免疫指标sIgA、免疫相关基因(CD80,Mfge8,CXCL13和CD79a)及细菌易位,结果表明:乳酸菌(LGG、Fn008、Fn022和Fn036)黏附派伊尔结能力与其增强PP巨噬细胞吞噬活性及产生sIgA能力呈正相关;乳酸菌(LGG、Fn008、Fn022和Fn036)可诱导抗原呈递细胞特异基因(CD80和Mfge8)和B细胞趋化因子CXCL13表达上调,同时可抑制B细胞特异性基因CD79a表达,这种作用依赖于其黏附PP的能力;乳酸菌和Salmonella都诱导了Th1免疫;乳酸菌Fn008、Fn022、LGG和Fn036没有破坏肠道黏膜屏障,而Salmonella却破坏肠道黏膜屏障引起细菌显著易位。 为了研究乳酸菌Fn008经过不同处理后黏附PP能力与其免疫调节作用的关系,分别给小鼠灌胃活菌Fn008 (V-Fn008)、紫外灭活菌Fn008 (UV-Fn008)、热灭活菌Fn008 (HK-Fn008)、Fn008+Salmonella和Salmonella,连续3天,检测脾淋巴细胞增殖能力及其基因IL-12表达能力、腹腔和派伊尔结巨噬细胞吞噬能力、细胞因子(IL-4,IL-10,IFN-γ,TGF-β,IL-17)、黏膜免疫指标sIgA、免疫相关基因(CD80,Mfge8,CXCL13和CD79a)及细菌易位,结果表明:V-Fn008、UV-Fn008和HK-Fn008黏附PP的能力与其增强PP巨噬细胞吞噬能力及产生sIgA的能力呈正相关。V-Fn008、UV-Fn008和HK-Fn008可诱导抗原呈递细胞特异基因(CD80和Mfge8)和B细胞趋化因子CXCL13表达,同时可抑制B细胞特异性基因CD79a表达,这种作用依赖于其黏附派伊尔结的能力。口服V-Fn008、UV-Fn008和HK-Fn008都诱导了Th1细胞免疫,且UV-Fn008和HK-Fn008诱导的Th1免疫反应弱于V-Fn008;活菌Fn008能抑制Salmonell引起的细菌易位; 利用On-tools分析口服乳酸菌Fn008小鼠空肠派伊尔结显著改变的基因,研究相关的显著性通路,结果表明,口服乳酸菌Fn008引起空肠派伊尔结内的响应基因主要与免疫、黏膜屏障和其它通路(肌动蛋白骨架的调节和自然杀伤性细胞介导的细胞毒性等)通路有关。采用定量PCR结果表明,乳酸菌(LGG、Fn008、Fn022、Fn036、UV-Fn008和HK-Fn008)可诱导派伊尔结黏着斑通路中Itgb1、lamaα3和Thbs2三个基因表达上调,这种作用依赖于其黏附派伊尔结的能力;乳杆菌Fn008通过使黏着斑中的基因FAK表达下调,而上调Itgb1、lamaα3、Itgb4、Thbs2基因表达,从而抑制沙门氏菌引起的细菌易位。 总之,本研究结果表明,特定乳酸菌主要通过表面自由能介导的作用力黏附PP,其黏附PP性与其增强派伊尔结巨噬细胞吞噬活性及诱导sIgA产生的能力呈正相关;乳酸菌可诱导派伊尔结黏着斑通路中Itgb1、lamaα3和Thbs2三个基因表达上调、可诱导抗原呈递细胞特异基因CD80和Mfge8表达上调,同时可抑制B细胞特异性基因CD79a表达,这种作用依赖于其黏附派伊尔结的能力;乳杆菌Fn008通过使黏着斑中的基因FAK表达下调,而上调Itgb1、Itgb4、lamaα3、Thbs2基因表达,从而抑制沙门氏菌引起的细菌易位。