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樟芝深层液态发酵及其三萜类化合物的研究

陆震鸣  
【摘要】: 樟芝,别名牛樟菇和牛樟芝,是一种属于非褶菌目多孔菌科、只长于台湾的担子菌。由于其具有很好的生物活性,在台湾地区非常出名。研究表明樟芝具有十分广泛的生物活性,如保肝,抗乙肝表面抗原,抗氧化,抗癌等。本论文对实验室保藏的樟芝菌株进行了分子生物学鉴定,并观察了其生物学特性;以三萜类化合物为主要目标,对樟芝摇瓶培养条件进行了优化;对樟芝菌丝体进行了扩大培养并对发酵产物中的活性成分进行成分分析、提取富集和保肝活性评价。 采用的序列分析,对实验室保藏的樟芝菌种进行了鉴定。通过与NCBI数据库进行比对,确认该菌株的18S rDNA和ITS rDNA与樟芝模式菌株一致。进一步对该樟芝菌株的生物学特性进行了研究,并观察了樟芝深层培养过程中的产孢子情况。 建立了香草醛-高氯酸显色法用于测定樟芝三萜类化合物含量。通过实验确定最佳反应条件为:待测试样加热挥去溶剂,然后加入0.3 mL新制的5%香草醛-冰醋酸溶液及1.0 mL高氯酸试剂,在60℃恒温水浴加热20 min,冷却至室温,摇匀,在550 nm波长处测定,该显色反应灵敏度高,稳定性、重现性好。 以樟芝三萜产量为目标,通过单因素实验优化了樟芝摇瓶培养条件。优化后的培养条件:接种方式采用孢子接种法,接种量为1.53×105个/mL,温度为26℃,摇瓶转速为100 rpm,初始pH为4.5,发酵时间为12 d。优化后的培养基组成(g/L):葡萄糖20.0,蛋白胨10.0,MgSO4为1.0,KH2PO4为2.0,麸皮2.0。在单因素实验的基础上,对显著影响樟芝生物量和三萜产量的培养基组成进行了RCCD优化实验,并将实验结果采用BP人工神经网络进行训练,进一步采用遗传算法得到ANN模型中的最佳条件:接种孢子数为1.09×105个/mL,葡萄糖浓度为32.93 g/L,蛋白胨浓度为2.81 g/L,黄豆粉浓度为2.01 g/L。摇瓶培养12 d的樟芝胞内三萜产量最高可达63.14 mg/L。经实验验证,得到樟芝三萜产量为55.89±2.43 mg/L,与预测值相比,误差为11.48%。较优化前的25.22 mg/L提高了121.6%。 研究了香樟树枝和树叶不同提取物对摇瓶培养樟芝生物量和三萜含量的影响。香樟石油醚提取物和乙酸乙酯提取物均能提高樟芝菌丝体中三萜的含量。其中以香樟树枝石油醚提取物(PES)(0.05 g/L)对樟芝三萜含量的提高作用最显著,三萜含量达到23.20 mg/g,比对照组提高了30.78%。通过GC-MS分析,从PES中共鉴定了39种化合物,主要为萜类化合物(28种,50.86%),包括单萜类化合物9种(30.57%),倍半萜19种(20.29%)。进一步考察了PES中所含的L-芳樟醇,蘑菇醇,桉树脑,樟脑,樟烯,α-松萜,α-松油醇,γ-萜品烯,反式石竹烯等化合物对樟芝生物量、三萜含量和产量的影响,发现α-松油醇对樟芝菌丝体三萜含量、三萜产量均有促进作用。α-松油醇能够促进樟芝挥发性萜类化合物的产生,可能通过影响萜类化合物合成途径提高樟芝萜类物质产量。 在摇瓶培养的基础上,对樟芝菌丝体进行了5 L发酵罐扩大培养,并考察了搅拌转速、接种量对樟芝三萜产量的影响。结果表明,较优的搅拌转速为50 rpm,较优的孢子接种量为1.0×105个/mL。樟芝菌丝体发酵培养7 d可以获得最大的生物量(6.51 g/L),在生长8 d后胞内三萜产量达到最大(48.90 mg/L)。 对5 L发酵罐培养所得的樟芝菌丝体深层发酵产物的成分进行了较为全面的分析。结果表明:樟芝发酵产物含有钾、钙、钠、镁、铁、锰、锌、铜等8种矿物质元素。樟芝菌丝体、孢子粉和发酵液中饱和脂肪酸的相对含量分别为55.32%,58.62%和60.79%,包括棕榈酸和硬脂酸。不饱和脂肪酸相对含量分别为43.15%,40.52%和39.18%,包括棕榈油酸,油酸,亚油酸和亚麻酸。樟芝发酵产物中共检测到18种氨基酸,菌丝体和孢子粉的18种氨基酸总量分别为26.49 g/100g和30.56 g/100g,其中谷氨酸含量最高。樟芝胞内多糖和胞外多糖均由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,但是三种单糖在不同多糖中的比例不同。 分别在发酵液和菌丝体中分析得到49种和55种挥发性化合物,其中包括22种醇类化合物、8种酮类化合物、7种醛类化合物、23种酯类化合物、5种萜烯类化合物、3种芳香族化合物。樟芝发酵产物的总体香味主要为蘑菇香,水果香和花香。樟芝的蘑菇味主要由C8脂肪族化合物贡献,包括3-辛醇,1-辛烯-3-醇等。一些内酯类物质,比如γ-辛内酯和γ-癸内酯等,对樟芝发酵产物所具有的水蜜桃香味贡献较大。另外,一些萜烯类和萜醇类化合物(如T-杜松醇、L-芳樟醇等)所具有的植物香味对樟芝发酵产物的香味也具有不同程度的贡献,其中以L-芳樟醇(柑橘味)的香气强度较大。 在单因素实验的基础上利用响应面法确定了樟芝胞内三萜提取的最优工艺参数。最终确定樟芝三萜提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度86%,提取温度75℃,液固比37,提取次数2次。在此条件下樟芝三萜得率理论最大值3.23%。同时对乙醇提取樟芝胞内三萜的动力学进行了研究。根据Fick第二定律导出的数学模型与樟芝胞内三萜实际提取过程较为一致,ln[C∞/(C∞-C)]与时间t具有良好线性关系,表明樟芝菌丝体三萜类化合物的溶出速度由孔内扩散控制。研究了大孔树脂富集樟芝胞外三萜的工艺。通过静态和动态吸附性能的比较,筛选出对樟芝胞外三萜类化合物吸附性能较好的大孔树脂XAD-16,并优化了其对三萜类化合物的分离条件:被分离样品溶液的pH为6.0,溶液中三萜类化合物的初始浓度为0.97 mg/mL,流速为2 mL/min,解吸附溶剂为乙醇。大孔树脂对于樟芝胞外三萜的吸附主要是通过范德华力、辅以氢键作用而进行的。通过方程拟合,证明大孔树脂对三萜类化合物的吸附为单层吸附。且吸附过程中,温度升高会减少吸附量。 建立酒精性肝损伤细胞模型并对樟芝发酵产物的保肝作用进行了评价。结果表明,樟芝发酵产物中对酒精性肝细胞损伤具有保护作用的物质主要存在于菌丝体中,菌丝体乙醇提取物和水提取物均具有保护酒精性肝细胞损伤的作用。樟芝菌丝体醇提物(25μg/mL)和水提物(200μg/mL)处理酒精性肝损伤细胞48 h后,细胞存活率分别提高为57.71%和63.60%,与乙醇诱导组相比具有显著性差异。


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