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凝结芽孢杆菌在杉木生物炼制中的应用及其抗逆机制的研究

欧阳水平  
【摘要】:杉木是我国主要的人工速生林资源,每年有大量的杉木加工剩余物产生未得到有效利用。杉木加工剩余物的资源化利用属于林业工程领域研究方向,其主要组分纤维素、半纤维素和木质素经过化学及生物转化转变为单糖、乳酸等平台化合物及酚类等化工品可以有效提高废弃资源利用度并减轻环境压力。然而,杉木作为典型针叶材,木质纤维结构具有极强的生物拮抗性,生物炼制过程面临预处理效率不高、酶解困难和较强预处理条件产生大量抑制物严重影响微生物发酵两大科学问题,限制了其产业推进。本文以杉木加工剩余物为研究对象,以杉木木屑全组分高效转化为目标,开展木质纤维解聚过程各组分脱除规律研究,通过联合预处理在克服杉木高顽固性酶解屏障同时,实现杉木三大组分梯级拆分,并在此基础上定向驯化凝结芽孢杆菌,实现对半纤维素和纤维素的高效转化制备乳酸,并初步探索了生物精炼剩余物氧化木素的性质和应用潜力,同时对凝结芽孢杆菌菌株抗逆的分子生物学机制和关键基因元件进行解析,成功构建高抗逆菌株。主要结果如下:(1)单一预处理无法实现杉木木屑中半纤维素和木质素的同步移除,半纤维素和木质素脱除存在交互作用,半纤维素的存在影响木质素的脱除,采取优先脱除半纤维素策略有利于杉木木屑预处理木质素的溶出。建立稀硫酸-亚氯酸钠联合预处理(DSASCP)可实现纤维素、半纤维素和木质素组分梯级拆分。半纤维素组分主要在第I稀酸阶段选择性溶出,脱除率为92.3%;木质素主要在第II氧化段选择性拆分,溶出率为93.2%;纤维素组分主要以固形物形式存在,DSASCP处理后的固形物中葡聚糖含量为79.3%,半纤维素3.1%,木质素含量6.3%。(2)杉木木屑酶解糖化的限制性因素首先是木质素脱除率,其次是半纤维素脱除率,建立了基于半纤维素和木质素脱除率的杉木酶解经验模型,该模型具有较高可信度,可用于杉木物料酶解性能的预测。DSASCP联合预处理物料具有优异的酶解性能和可发酵性。总底物浓度为160 g/L葡聚糖的预处理底物采用补料方式酶解,水解液中葡萄糖浓度可达138.8 g/L,酶解率为77.7%。采用S.cerevisiae NL22对酶解液进行发酵,12 h乙醇浓度为64.6 g/L,为理论转化率的93.2%。(3)以含有多种抑制物的真实稀酸预处理液为驯化压力通过适应性驯化获得可利用45%预处理液发酵制备乳酸的高抗逆性B.coagulasn CC17A。利用B.coagulasn CC17A建立生物质一锅法生产乳酸工艺,预处理、酶解糖化和发酵在同一反应器进行,无需固液分离和水洗脱毒,80 g小麦秸秆可生产乳酸35.5 g,为理论碳水化合物生产乳酸的70.9%。(4)从代谢水平和转录水平分析研究B.coagulans CC17A的抗逆机制。B.coagulans CC17A除了具有呋喃醛和酚醛还原能力,还具有酚酸脱羧转化能力。转录组分析显示B.coagulans CC17A共有331个基因在环境胁迫下出现显著差异表达,主要涉及转运体和跨膜转运体、需要辅因子蛋白、氧化还原过程和膜组分。B.coagulans CC17A的抗逆机制包括ABC跨膜运送蛋白、氧化呼吸链中细胞色素C氧化酶和血色素合成相关基因表达增强和应激高盐环境的硫转运和降解代谢通路整体上调。(5)以B.coagulans DSM1为宿主菌株构建凝结芽孢杆菌过表达体系,筛选转录显著上调表达的氧化还原酶以及酚酸脱羧酶,研究其影响菌株酚醛和酚酸抗逆的分子机理。RS25280作为酚酸脱羧酶在酚酸抗逆中起主导作用,过表达不仅可促进凝结芽孢杆菌在非氧化状态下降解酚酸从而提升对酚酸耐受,还首次发现酚酸脱羧酶的存在有利于香草醛的转化,通过间接形式促进香草醛转化为低毒物质;RS25275作为氧化还原酶过表达对紫丁香醛转化促进最明显,在酚醛抗逆中其主导作用。凝结芽孢杆菌非氧化脱羧和氧化还原酶还原过程对酚酸和酚醛降解具有交互影响。(6)结合联合预处理和高抗逆菌株形成杉木木屑生物精炼集成技术。建立基于两段预处理的稀酸预处理液回用技术,可节约酸液使用量54%,提高半纤维素水解液糖浓2.80倍;以高抗逆B.coagulans CC17A分别对拆分后的半纤维素和纤维素组分进行乳酸发酵。在不脱毒情况下,B.coagulans CC17A直接以100%杉木稀酸回用水解液为碳源发酵,糖酸转化率为79.9%,通过分批补料同步糖化发酵利用预处理底物,乳酸浓度最高可达128.8 g/L。最终3 kg杉木木屑经过预处理、纤维素和半纤维素发酵共可生产乳酸1.1 kg,通过调节p H选择性沉淀可获得0.49 g O-lignin。结构分析显示氧化木素β-O-4醚键被大幅度破坏、苯环之间β-β和β-1连接键被打开,断裂严重,但仍然保留了部分苯环结构,以愈创木基为主,为后续热解聚生产高选择性的愈创木酚产品提供空间。


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