树干毕赤酵母戊糖连续发酵及低pH值处理技术

【摘要】：当今人类社会主要面临着人口膨胀、资源短缺、环境污染、能源匮乏等多种危机，其中能源问题尤为严峻。人类急需从这些危机中摆脱出来，进入一个理想的可持续发展的轨道。在这个过程中，包括生物技术在内的高技术的发展和应用将可能发挥重要作用。植物纤维原料包括纤维素、半纤维素和木质素，是地球上最丰富的生物可再生资源，利用其作为廉价的糖源生产燃料酒精是解决世界能源危机的最有效途径。 本文研究了树干毕赤酵母(Pichia stipitis)生长和戊糖发酵的规律；通过建立酵母稳态连续培养进行了戊糖发酵时碳元素的物料衡算和代谢流向分析；在游离态酵母连续发酵植物纤维原料模拟水解液的基础上，结合固定化技术和低pH值处理技术来解决连续发酵中的染菌问题等。主要研究结果如下： 研究了不同氮源条件下树干毕赤酵母的生长和发酵木糖的规律。结果表明，硫酸铵和硝酸钾作为氮源增殖效果较差，而用尿素作唯一氮源增殖酵母时，酵母最终浓度与单独采用蛋白胨时相接近。分别以蛋白胨、尿素、硫酸铵和硝酸钾为氮源，以40.0g／L木糖为树干毕赤酵母的发酵底物，经过36h发酵，酒精浓度分别为17.29、15.07、13.76和13.46g／L；酒精得率与理论得率之比分别为97.30、94.79、78.03和84.84％。 研究了影响树干毕赤酵母生长和发酵两个重要因素温度和pH值，采用30.0g／L木糖和30.0g／L葡萄糖混合糖液为增殖碳源，研究表明，树干毕赤酵母在pH值3.0～4.0这一较低pH值范围仍能正常生长，但从酵母最终浓度和得率考虑，树干毕赤酵母生长最适pH值范围为4.6～5.8；从酵母的生长速度考虑，最适生长温度范围为30～35℃。当采用40g／L木糖为发酵底物进行木糖发酵研究，结果表明，当发酵温度为35℃，pH值3.8～5.0时发酵液中的酒精浓度较高；而当发酵温度为25℃时，酒精浓度和木糖利用率较高的pH值范围为3.4～4.2。 在不同培养条件下，对树干毕赤酵母进行了两次不同稀释率的连续培养。在厌氧连续培养时以30.0g／L葡萄糖为碳源；在限制供氧连续培养时以30.0g／L葡萄糖和15.0g／L木糖的混合糖为碳源。两者相同的规律是，随着稀释率的升高，酵母浓度和酒精浓度不断下降，而残糖浓度逐渐升高；但酒精产率不同，厌氧连续培养在稀释率为0.14h~(-1)时，酒精产率达到最大值1.110g／L·h；在限制供氧条件下当稀释率为0.06h~(-1)时，酒精产率达到最大值0.790g／L·h。 实验还对树干毕赤酵母进行了4个阶段共400 h连续恒化培养，在不同阶段流加不同底物糖而形成4个“稳态”期，分别进行碳元素的物料衡算和代谢流向分析。结果表明，4个“稳态”期的碳元素回收率分别为118.03、105.59、113.51和94.72％。当底物为15.0g／L木糖和30.0g／L葡萄糖混合糖时，酵母发酵代谢后有41.19％的碳元素流向了酒精；当底物为30.0g／L木糖和30.0g／L葡萄糖混合糖吋，该值仅有34.46％。 研究了游离树干毕赤酵母单级连续发酵，在稀释率0.08 h~(-1)下采用葡萄糖和木糖比例为2：1，总糖浓度不同的混合糖为底物。结果表明，随着底物浓度不断上升，溢出液中残留的总还原糖浓度也不断上升，但酒精浓度的上升幅度并不大；特别是当底物浓度大于 60.09几时，酒精浓度维持在14.5一巧.5终之间，酒精得率与理论得率之比在79.8一85.4 %范围之内。 本文还研究了游离树干毕赤酵母二级串联连续发酵。结果表明，在底物流速约为60.0 n1L小的第1轮发酵中，在稳定期(11一巧天)，45.0 glL还原糖在罐1中平均被利用了 32.35叭，罐1酒精平均浓度为12.36叭，余下的12.65叭还原糖在罐2中继续发酵了 5.04叭，罐2中酒精浓度平均值为13.79叭;在底物流速为 45.Om功的第2轮连续发 酵中，在稳定期(11一15天)，45.0妙还原糖在罐1中平均被利用了34.379几，罐1中 酒精浓度平均值为H .429几，余下的10.639几还原糖在罐2中平均继续发酵了6.319几， 罐2中酒精浓度平均值为巧.41叭。 实验以游离树干毕赤酵母为发酵菌株，采用巧.0 g/L木糖和30.0 g/L葡萄糖混合物为 发酵底物，共进行了22天二级连续发酵，期间对罐1共进行了3次不同低pH值的处理。 结果表明，当底物流速为30 InL币时，尽管是游离酵母连续发酵，但经过1一2天的适应 性发酵，罐1的各项发酵指标基本上都得以恢复。其中平均残糖浓度从最初的8.52 glL分 别变为7.80、10.08和ro.02叭，相应地，酒精浓度、糖利用率、酒精得率都略有下降。 研究了海藻酸钙固定化树干毕赤酵母的单级连续发酵，采用两个流速(O一6天:45.0 m眺;7一12天:67.5 mL小)来流加45.0叭底物。研究表明，仅经过3天的波动，发酵 罐中各种物质浓度已趋于恒定，此后3天游离酵母浓度、还原糖浓度、还原糖利用率、酒 精浓度、酒精得率与理论之比的平均值分别为2.09叭、7.89泌、82.47%、巧.75泌和 84.84%。第7天，提高底物流速，发酵罐中各项发酵参数很快重新达到稳定状态。最后 3天游离酵母浓度、还原糖浓度、还原糖利用率、酒精浓度、酒精得率与理论之比的平均 值分别为1.88叭、10.509/L、76.67%、14.34g/L和52.35%。 最后实验以游离树干毕赤酵母为发酵菌株，结合固定化和低pH值处理技术进行了混 合糖二级串联连续发酵的研究，共进行