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杉木转基因受体系统的建立及遗传转化研究

席梦利  
【摘要】:杉木是我国特有的常绿针叶树种之一。因其生长快,木材质量高,成林又迅速,而成为重要的商品用材和造林树种。本文以杉木幼胚、成熟合子胚、实生苗的子叶和下胚轴、试管苗茎段等不同外植体进行器官发生和体细胞胚胎发生研究,探讨了不同因素对器官发生或体胚发生的影响。在国内外首次诱导出了杉木体细胞胚并再生出植株,填补了国内外该领域的研究空白;建立了适于杉木遗传转化的稳定高效的组培受体系统;用石蜡切片方法,观察了不定芽和体胚的发生和发育过程;通过研究7个影响杉木转化效果的因素,初步确定了杉木茎段较为合适的转化体系,为杉木基因工程育种提供了关键的技术平台。 以杉木成熟合子胚及幼胚为起始外植体,研究了基本培养基、植物激素、凝固剂种类、有机附加物、合子胚的发育阶段等因素对杉木愈伤组织的诱导、愈伤组织的继代培养及不定芽分化的影响。结果表明:1/2MS+2,4-D 2mg/L+6-BA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖30g/L是成熟合子胚诱导愈伤组织的最佳培养基;以该配方诱导幼胚,处于胚胎选择阶段和组织与器官分化阶段的幼胚,能诱导出松软、晶莹透明的愈伤,诱导频率为2-6%。处于组织和器官分化及成熟阶段的幼胚,诱导出愈伤的外观形态与成熟合子胚诱导出的愈伤相似,愈伤组织的诱导频率随着合子胚发育的成熟而迅速提高;1/2MS+2,4-D 1mg/L+6-BA0.5mg/L+KT 0.5mg/L+蔗糖30g/L适于杉木愈伤组织继代增殖;DCR+6-BA 1.5mg/L+KT1.5mg/L+蔗糖20g/L是诱导不定芽发生的最佳培养基。 以杉木成熟合子胚及实生苗的子叶和下胚轴为起始外植体,研究了基本培养基、不同种类的细胞分裂素、苗龄等因素对杉木直接器官发生和体胚发生及不定芽生根的影响,用石蜡切片方法,观察了不定芽和体胚的发生和发育过程。研究结果表明:基本培养基、6-BA、TDZ及苗龄对成熟合子胚及实生苗的子叶和下胚轴不定芽发生和体胚发生均产生显著影响,而ZT、KT的影响不明显。DCR+6-BA 1.0mg/L+TDZ0.002mg/L+NAA 0.1mg/L对成熟合子胚诱导不定芽和子叶诱导体胚最有效;DCR+6-BA 1.0mg/L+TDZ0.003 mg/L+NAA 0.1 mg/L是成熟合子胚诱导体胚、子叶和下胚轴诱导不定芽发生的最佳培养基;不定芽在DCR基本培养基中可有效伸长;1/4MS+IBA0.2 mg/L+NAA0.1 mg/L对不定芽生根最有效。石蜡切片观察表明:不定芽有2种发生方式。一种是表皮及表皮下的3-4层细胞分生组织化发育而成,另一种是外植体内部的小维管束脱分化发育而成,两种发生方式均为直接器官发生途径。体胚发生不经过愈伤组织阶段,直接发生于外植体表面,为直接体胚发生途径。 以杉木试管苗靠近茎尖的茎段为外植体,通过改变预培养时间、蔗糖浓度、6-BA、TDZ、头孢霉素、卡那霉素浓度,探讨该因素对茎段再生芽的影响,最终建立了以茎段为外植体的高频再生系统。研究发现,DCR+6-BA 1.0mg/L+TDZ0.001mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20g/L培养基对杉木茎段芽的诱导最有效,预培养2d时,芽诱导频率、平均芽数和芽形成能力最高,分别为100%、6.35和6.35。石蜡切片观察发现,茎段发生的芽多起源 于茎段表面,是农杆菌容易抵达的位置,说明茎段附着农杆菌的细胞与再生芽的部位相 一致。 通过研究7个影响杉木转化效果的因素,初步确定杉木茎段较为合适的转化体系为: 预培养1一3d,OD。=0.1一0.4菌液浸染10一15min,共培养3一sd,共培养基pH值5.4附加 AS80 p mol/L,共培养后延迟3d筛选。本研究在初次筛选培养基上共得到186个Km抗性 芽,在二次筛选培养基获得39个Km抗性芽。PCR检测有2个Km抗性芽呈稳定阳性,初 步证明外源GAFP基因己整合到这两个Km抗性芽的基因组 DNA中。 关键词:杉木,器官发生,体胚发生,农杆菌介导,转基因


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