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低聚木糖单一组分的制备分离及其用于双歧杆菌的体外培养

张军华  
【摘要】:本文研究了聚丙烯酰胺凝胶分离低聚木糖的规律;首次建立了大量制备分离低聚木糖单一组分的凝胶过滤层析系统,获得了可用作分析标准品的木二糖和木三糖;首次采用体外间歇厌氧培养的方式,对青春双歧杆菌代谢低聚木糖及低聚木糖单一组分的规律和机理进行了研究。 对低聚木糖组成和结构的分析表明,低聚木糖中阿拉伯糖基含量为14.75 %,低聚木糖中大部分为中性木二糖至木六糖,少量为酸性低聚木糖,此外还含有木聚糖、酶蛋白和木质素。高效液相色谱和电喷雾电离质谱分析表明,木二糖和木三糖不含阿拉伯糖基和4-O-甲基-葡萄糖醛酸基。木五糖和木六糖含有带阿拉伯糖基的同分异构体。 以超纯水为洗脱液,采用聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel P-2 分离低聚木糖时,可按分子量顺序依次得到纯度较高的木二糖至木六糖。分离低聚木糖过程中,分子量是影响分离的主要因素,木糖至木六糖和聚丙烯酰胺凝胶之间不存在非特异性吸附现象。分离过程中相邻两峰间的分离度R 介于0.60~1.11 之间,选择因子a 均小于1.2。综合分离效率和产率两种因素,最适的洗脱速度为12 ml/h。 以AKTA FPLC 为控制系统,以XK 50/60 为层析柱,层析介质Bio-Gel P-2,柱温48℃,脱气超纯水洗脱,洗脱速度120 ml/h,采用示差折光和280 nm紫外线同时检测,可用于制备分离低聚木糖单一组分。通过二次分离手段制备出纯度分别为97.08 和94.19 %的木二糖和木三糖,可用作分析标准品。 以低聚木糖为碳源在体外培养青春双歧杆菌48 h后,培养液总糖浓度从5.0 g/L 降至3.21 g/L,pH 值从7.0 降至4.70,培养过程中获得的最大菌体浓度为0.37 g/L。它增殖青春双歧杆菌的能力强于木糖,但较葡萄糖差,其中平均聚合度较高的低聚木糖组分增殖能力较差,平均聚合度小于7 的低聚木糖组分增殖能力较强。代谢过程中,不同平均聚合度的低聚木糖组分所含的阿拉伯糖基侧链均会被青春双歧杆菌分泌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶水解释放出阿拉伯糖。各组分在培养过程中都有木糖累积现象。低聚木糖被青春双歧杆菌代谢至24 h时后,其乳酸、乙酸、丙酸和丁酸浓度分别为2.34、1.60、0.36 和4.07 g/L。 对青春双歧杆菌代谢木二糖的规律进行了研究。研究结果表明,青春双歧杆菌代谢木二糖48 h后,培养液总糖浓度从5.0 g/L 降至2.93 g/L,pH 值从7.0 降至4.38,培养过程中获得的最大菌体浓度为0.33 g/L。木二糖增殖青春双歧杆菌的能力和低聚木糖相当,强于木糖和平均聚合度较高的低聚木糖组分,但较葡萄糖差。代谢过程中无阿拉伯糖产生,有木糖累积现象。培养至24 h时代谢产物以乳酸和乙酸为主,它们的浓度分别为4.38 和2.62 g/L,丙酸浓度为0.47 g/L,在24 h 的培养过程中不产生丁酸。 对青春双歧杆菌代谢木三糖的规律进行了研究。研究结果表明,青春双歧杆菌代谢木三糖48 h后,培养液总糖从5.0 g/L 降为1.65 g/L,pH 值从7.0 降为4.44,培养过程中获得的最大菌体浓度为0.47 g/L。木三糖对青春双歧杆菌的增殖能力强于木二糖和低聚木糖,较葡萄糖差。代谢过程中无阿拉伯糖产生,有木糖累积现象。培养至24 h时的代谢


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