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松材线虫SCAR标记与分子检测技术

陈凤毛  
【摘要】:针对松材线虫形态鉴定存在的不足,本文开展了以下四个方面的研究工作:(1)松材线虫与拟松材线虫的RAPD 检测技术的研究;(2)松材线虫与拟松材线虫的SCAR 分子标记;(3)松材线虫与拟松材线虫核糖体基因(rDNA)限制性片断长度多态性研究;(4)松材线虫快速检测试剂盒的构建。 实验所用线虫样本共35 个。其中19 个松材线虫株系分别来自于美国、加拿大、中国、日本,13 个拟松材线虫株系分别来自日本、韩国、中国以及中国台湾地区,3 个线虫未定种分离自我国主要松林分布区的枯死松树。 实验取得如下研究结果: 1、大量线虫基因组DNA 的提取采用裂解法直接提取,不需要研磨,减少DNA 的损失。所提取的DNA 质量较好,OD260/OD280 值在1.7-1.9 之间,样本DNA 含量在300-630 微克/毫升。少量线虫采用切割法提取,线虫经液氮处理10min 或-70℃处理15min 或-20℃处理40min,均能够扩增出谱带。 2、通过RAPD 技术,从140 个随机引物中筛选出7 个特异性随机引物OPC08、OPC18、OPC19、OPK09、OPM05、OPN09 和OPY01,共扩增出12 个特异片段,其中7 个松材线虫特异片段,5 个拟松材线虫特异片段(。1)引物OPC08、OPK09 为松材线虫株系特异引物,OPC08 扩增特异片段长约760bp;OPK09 扩增出两条特异片段长度分别为1200bp、2400bp 左右。(2)引物OPN09、OPM05、OPY01 为松材线虫株系与拟松材线虫株系共有的特异引物。OPN09 扩增出两条松材线虫特异片段分别为480bp、880bp 左右,扩增出一条拟松材线虫特异片段长约620bp;OPM05 扩增松材线虫特异片段长约2100bp,扩增拟松材线虫特异片段长约1300bp;OPY01 扩增松材线虫特异片段长约730bp,扩增拟松材线虫特异片段长约850bp。(3)引物OPC18、OPC19 为拟松材线虫株系特异引物,OPC18 扩增特异片段长约970bp,OPC19 扩增特异片段长约1350bp。实验表明,这些随机引物具有特异性强、灵敏度高的优点。七个引物均可以区分松材线虫和拟松材线虫。 3 、将松材线虫与拟松材线虫RAPD 特异片段①OPC19-M1350 、②OPK09-X2400、③OPC18 -M970、④OPM05-X2100、⑤OPN09-X480、⑥OPM05-M1300、⑦OPK09-X1200、⑧OPY01-M850、⑨OPY01-X730 进行分离、回收、与载体pGEM?-T Vector 连接,转化大肠杆菌、培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物。9 个特异随机片段中,有4 个成功转化为SCAR 标记。其中( 1)OPK09-X1200 通过引物对K09F1/R 可转化为SCAR-K09-X837,通过引物对K09F2/R可转化为SCAR-K09-X340,均为松材线虫SCAR 标记;(2)OPM05-X2100 通过引物对M05F1/R1 可转化为SCAR-M05-X1127,通过引物对M05F2/R1 可转化为


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