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松墨天牛引诱剂和松材线虫分子检测技术研究

王焱  
【摘要】: 松材线虫病是当前严重危害我国和世界林业安全的松树毁灭性病害。因其病原物松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)危害严重且防治困难而被世界上许多国家列入检疫对象。松材线虫主要通过媒介昆虫松墨天牛(Monochamus alternatus)在松树上取食和产卵时进行自然传播。松墨天牛既是松材线虫病的媒介昆虫,又是我国松树的重要蛀干害虫。控制松墨天牛的种群不但可以减轻对松树的直接危害,而且可以阻止松材线虫病的的传播和扩散。 本论文在导师的指导下,通过全面查阅分析松材线虫病研究文献资料,确定松墨天牛补充营养阶段引诱与松材线虫快速检测为论文的主要内容开展了研究工作。 利用固相微萃取法和水蒸气蒸馏法分别提取了五种寄主植物的枝条和针叶的挥发物,结合GC-MS技术分析确定了挥发物的主要组分,并比较分析了主要挥发性物质的组成比例和含量在树种间、相同树种健康和受害木之间和枝条和针叶之间的差异。最后确定了对媒介昆虫松墨天牛引诱有效的植物挥发物的主要成分; 利用触角电位法开展了松墨天牛对信息化合物的的EAG和行为反应研究。根据GC-MS的分析结果,筛选出挥发物中十种主要组分进行生物测定,结果表明,单萜引起的电位值最大,芳香族物质次之,倍半萜最小。将单体化合物按照一定比例复配后,EAG反应值明显大于单体化合物的反应值,复配的化合物之间引起的EAG反应存在差异。嗅觉仪实验中,松墨天牛对复配的化合物引起的趋向反应有较明显的差异。对化合物剂量反应显示,随着浓度的增加,无论是电生理还是行为反应均增强,但雌雄虫对同一化合物的反应阈值是有差异的。同时开展了松墨天牛对感病寄主与健康寄主提取物的EAG和行为反应研究,生物测定结果表明,交配前,健康木比松材线虫危害木能够引起未交配天牛更加明显的触角电位反应;在嗅觉仪中对健康木的表现为正趋性,对松材线虫为害的黑松均呈负趋性。而交配后,雌雄天牛对松材线虫危害木的EAG反应值显著大于对健康木的;在嗅觉仪中对健康木的表现为正趋性,成虫对黑松健康木均呈负趋性,而对松材线虫危害木呈正趋性。在健康木挥发物的日龄变化的反应中,羽化后的成虫随着日龄的增加,EAG反应值和趋性反应都逐渐提高,15日龄后,EAG反应和行为反应的变化均无规律。在上述研究的基础上开展了引诱剂的筛选及其引诱作用的研究,初步开发研制了引诱效果良好的松墨天牛引诱剂。 通过开展松材线虫特异性引物PCR检测技术法与ITS-PCR-PFLP检测技术比较研究,根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物与探针TaqMan-MGB;结合利用实时荧光PCR快速检测技术,成功研制了松材线虫实时荧光PCR快速检测试剂盒。利用该试剂盒F/R检测单条线虫,其结果显示,来自日本、美国、以及我国安徽、浙江、广东、江苏等病区的7个松材线虫株系均表现有荧光信号,且CT值在18-25之间。而来自韩国、中国台湾、湖北、江苏的4个拟松材线虫株系、美国、中国山东的大核滑刃线虫、中国四川的霍夫曼尼伞滑刃线虫、江苏的长尾属线虫等8个线虫株系以及1个无模板的对照(CK)均无阳性扩增信号,检测不到CT值。表明该探针与引物组合具有较强的特异性。另外将已知浓度的松材线虫DNA样品稀释为10、1、0.1、0.01 ng/μL以及1 pg/μL等5个浓度梯度,检测其扩增灵敏度,结果显示样品模板DNA含量大于1 pg/μL时,该探针与其配套引物就可检测到松材线虫的扩增信号。在10μL的反应体系中,该探针及其引物对可检测到0.5 pg的松材线虫DNA浓度,其灵敏性非常高。同时利用来自不同地区的80个松材线虫样本,8个拟松材线虫样本,2个霍夫曼尼伞滑刃线虫样本,3个大核滑刃线虫样本, 2个长尾属线虫样本,1个无DNA模板对照样本对研究设计的TaqMan-MGB探针进行检测验证,结果显示,所有80个松材线虫样本均有较强的阳性扩增信号,其CT值为13-24。其它拟松材线虫、伞滑刃线虫、大核滑刃线虫和长尾属线虫样本,1个无DNA模板对照均没有荧光信号,无CT值。本研究设计的TaqMan-MGB探针与引物组合F/R具有广泛的应用价值。本套探针和引物设计已被中华人民共和国国家知识产权局授予发明专利权。


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