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湿地松、火炬松离体培养植株再生技术的研究

吴丽君  
【摘要】: 湿地松、火炬松自上世纪30年代引种至今,两树种已成为我国南方地区大面积造林的主要经济树种。然而,其相对滞后的良种繁育技术仍然制约着两个树种的发展。本研究以湿地松、火炬松不同组织器官为材料,对其直接器官发生、间接器官发生、直接体胚发生等离体培养快繁技术进行系统研究,以建立高效、稳定的湿地松、火炬松离体培养植株再生体系,为其它针叶树种的组培快繁技术提供借鉴。研究的主要内容及结果以下: 一.湿地松直接器官发生与植株再生技术 以湿地松(Pinus elliottii Engelm)抗病家系和非抗病家系的成熟合子胚为外植体,以不同基本培养基、激素种类及浓度配比和不同的培养方式,研究湿地松离体培养继代增殖的关键技术及主要影响因子。研究结果表明湿地松家系或基因型、继代代数及激素种类浓度的配比是湿地松组培继代增殖效率的主要影响因子。湿地松组培快繁的最佳增殖培养基为B5+6-BA2.0mg/L+IBA0.1mg/L,年增殖率可达3.696.2。利用家系间或家系内个体间增殖率的显著差异,筛选了适宜组培快繁的普通家系优良基因型132个、抗病家系优良基因型2个。通过固体培养与添加液体营养液的双层培养基的培养方式解决了湿地松继代增殖率与有效芽苗率的消长问题,有效缩短了继代周期,简化了培养程序。 生根培养阶段,通过对培养基大量元素浓度水平的对比试验,结果表明生根培养初期以无大量元素培养基诱导生根,25d后添加大量元素的培养程序可有效缩短生根培养时间,提高生根率,达到理想的生根效果。 本研究基本解决了湿地松长期继代增殖及生根技术问题,建立了稳定的离体快繁增殖及生根体系。但该培养技术的产业化应用还需进一步的中试及相关操作工艺设备的改进,以降低组培苗的生产成本。 二、湿地松间接器官发生与植株再生技术 以湿地松成熟合子胚、胚苗顶芽、下胚轴、胚根为外植体,选用低盐量的DCR、LP、TX 3种基本培养基,与不同浓度NAA、2,4-D及不同浓度6-BA组合,研究湿地松器官性愈伤组织诱导、增殖及器官分化培养阶段的关键技术。试验结果表明:成熟合子胚、胚苗顶芽是诱导器官性愈伤组织理想的外植体,诱导器官性愈伤组织的最佳培养基为TX+BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+30 g/L蔗糖,诱导率高达50%以上;增殖培养基为TX+BA 0.3 mg/L+NAA 1.0 mg/L+CH 400 mg/L+30 g/L蔗糖,继代周期25~30d,增殖率达3.46;器官分化培养基为TX+BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖,每块愈伤组织可分化20个以上不定芽;不定芽的同步化发育培养基为TX+BA 0~0.2 mg/L+IBA 0.5 mg/L+30 g/L蔗糖;NAA是器官性愈伤组织诱导、增殖必不可少的生长素。湿地松间接器官发生程序复杂,但其增殖效率远远高于直接器官发生效率。 组织细胞学研究结果表明:亮白色、半紧实结构的外部形态及大量“拟分生组织”的内部结构的形成是器官性愈伤组织的重要标志。不定芽原基的分化发育过程约为40~45d。 三、湿地松体细胞胚胎发生 以湿地松成熟合子胚及未成熟合子胚为外植体,对影响湿地松体胚诱导、ESM维持与增殖培养及体胚成熟等关键技术环节的主要因素进行系统研究。研究结果表明:多胚特征的合子胚发育阶段是湿地松体胚诱导最理想的外植体,即发育第2、3、4阶段的合子胚。基本培养基、激素种类浓度组合及两因素的交互作用对ESM诱导率及外植体褐化率均有极显著影响,湿地松体胚发生最佳培养基激素组合为LP+ 2,4-D 2.2 mg/L +6-BA 1.0mg/L和DCR+ NAA2.0 mg/L +6-BA0.63 mg/L+KT0.61mg/L,4个家系在两种培养基ESM平均诱导率分别为24%和22.75%。球果短时间冷藏处理、雌配子体“倾斜接种”方式以及在培养基添加乙烯抑制剂及pH缓冲液均有利于提高湿地松体胚诱导率,采用国产琼脂代替进口Phytagel作为植物凝胶剂可起到同样的诱导效果。 ESM维持培养阶段,胚性组织胚性的失去或因生长势的衰弱而死亡是针叶树种体胚发生的普遍现象。通过对培养基与激素组合的优化获得了4个可长期快速增殖的胚性细胞系,DCR+NAA 1.0 mg/L +6-BA 0.32 mg/L + KT 0.30 mg/L为湿地松ESM的最佳增殖培养基。生长素是维持胚性的极性结构所必需的,但高浓度的生长素对体胚的生长、发育成熟不利,尤其是高浓度2,4-D可能导致体胚的畸形。 添加AC的无激素预培养是体胚发育成熟的必要条件。ABA是体胚从增殖到成熟转化的关键因素。外源ABA与PEG和高浓度蔗糖的组合进一步促进了体胚的发育成熟,湿地松体胚在成熟培养基PL+ABA 50 mg/L+PEG6000 20%+6%蔗糖上获得了发育5阶段的子叶胚。 四、火炬松体细胞胚胎发生 以火炬松优良家系20-692、20-615、20-1036、20-639不同球果采收期合子胚为外植体,选用4种针叶树体胚发生专利培养基AL、TX、LP、DS分别与AL、TX、LP培养基激素组合及无激素组合形成16种体胚诱导培养基,开展火炬松体胚诱导试验。研究结果表明:体胚诱导最理想的外植体为第2、3、4发育阶段合子胚。外植体基因型是影响体胚诱导率的关键因素,通过培养基、激素组合及其它培养条件的优化是打破离体培养顽拗型基因型限制的有效措施。LP+2,4-D 2.2 mg/L +6-BA 1.0mg/L、AL+2,4-D 2.2 mg/L +6-BA 1.0mg/L培养基可获得较高的体胚诱导率,且体胚质量高。 不同的胚性细胞系对体胚成熟培养反应不同,只有具有完整体胚的培养物转入成熟培养基,体胚才能进一步的发育成熟。火炬松胚性细胞系AL-225经无激素培养基预培养后转入AL+ABA 50 mg/L+15%PEG8000的成熟培养基,体胚得以进一步的发育,但未能获得完全成熟体胚。 以火炬松成熟合子胚为外植体获得了可持续增殖的ESM。但成熟合子胚体胚诱导率仅为3%,远远低于非成熟合子胚诱导率。但成熟合子胚体胚发生技术仍具有重要的研究价值。


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