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β-葡萄糖苷酶的制备与回收利用及其基因的克隆表达

赵林果  
【摘要】: 在木霉纤维素酶水解植物纤维过程中,添加外源β-葡萄糖苷酶是提高可发酵性单糖得率、降低酶用量的一种行之有效的方法。因此,外源β-葡萄糖苷酶的活力及其使用成本能否满足工业化应用的需要至关重要。 论文以制备高活力外源β-葡萄糖苷酶及多次重复利用β-葡萄糖苷酶为目标,优化了β-葡萄糖苷酶高产菌的培养条件并对产酶过程进行了pH值和补料调控;分离纯化了两种胞外β-葡萄糖苷酶酶和一种胞内β-葡萄糖苷酶酶,研究了其酶学特性;建立了超滤法、丙酮沉淀法、固定化酶法回收利用β-葡萄糖苷酶的方法及其工艺;并对β-葡萄糖苷酶的基因进行了克隆和表达。主要结果如下: (1)筛选获得β-葡萄糖苷酶高产菌株A.niger-NL-1,第4 d时,酶活力最大值达到4.7 U/ml。在分泌β-葡萄糖苷酶的过程中,该菌株能产生较高活力的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶,滤纸酶活达到0.62 IU/ml。并且,粗酶液中β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶具有较强的耐酒精特性。 (2)产酶时适宜的初始pH值为5.0。将产酶期的pH值控制在4.0左右有利于β-葡萄糖苷酶的分泌,120 h时酶活力达到6.12 U/ml。 (3)产酶过程中经过四次补加麸皮,酶活力提高了近3倍。补料发酵工艺中,适宜的麸皮初始浓度为3%,在补料总量一定时,采用递减补料方式效果最好,其酶活力达到7.0 U/ml。分批补料培养是一种很好的提高酶产量的方法。 (4)采用盐析、疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤等步骤,纯化获得两种胞外β-葡萄糖苷酶,它们的单亚基分子量分别为114.6 KD和70.3 KD。高分子量的酶具有耐高糖特性,以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷为底物,葡萄糖的抑制常数K_i为41.01 mmol/L。两种酶均不需要依赖金属离子维持其活性,能被一定浓度的乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯激活。 (5)纯化获得一种胞内β-葡萄糖苷酶,其分子量大小为122.7 KD。甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂对该酶具有显著的激活作用。添加30%甲醇、30%乙酸乙酯、40%正丁醇、40%丙酮时,它们的相对酶活力分别为153%、162%、184%和146%。该类酶在合成工业中将具有很好的应用前景。 (6)选择截流分子量30 KD超滤膜回收纤维二糖水解液中β-葡萄糖苷酶比较适宜。连续超滤回收不同批次的纤维二糖酶解液中β-葡萄糖苷酶,第一轮的酶回收率、平均膜通量分别为99.5%和109.4 L/m~2.h;第二十轮回收的β-葡萄糖苷酶为初始加酶量的90%以上,且平均膜通量为79.2 L/m~2.h。利用丙酮回收水解液中β-葡萄糖苷酶时,丙酮与水解液的体积比在0.75~1.0之间比较适宜。用-20℃丙酮沉淀2 h,酶回收率为95.7%。连续沉淀不同批次的纤维二糖酶解液时,第15次的酶回收率仍能在50%左右,可节省所需酶量的78.97%。 (7)以海藻酸钠为载体制备的固定化β-葡萄糖苷酶重复利用20次仍能保持90%以上的酶解得率。以进料速度为1.5 ml/min,1.0 ml/min连续酶解时,酶解得率分别达到96.65%和99%。与单独采用木霉纤维素酶相比,在β-葡萄糖苷酶总活力与滤纸酶活之比为0.5(FPA=2.0 IU/ml)的条件下,固定化β-葡萄糖苷酶与木霉纤维素酶协同作用降解滤纸纤维素和微晶纤维素60 h,它们的水解得率分别增加了20.4%和29.3%。 (8)克隆了片段大小为2582 bp的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因,构建了β-葡萄糖苷酶基因表达载体pPICZα-A-bgl1,通过转化成功获得了重组毕赤酵母。 (9)在适宜的条件下,重组酵母一步式发酵的第5d酶活力达到11.29 IU/ml,产酶能力明显高于二步式,且产酶周期大大缩短。利用二次电转化技术获得了多拷贝数的重组子,其表达量比一次电击获得的优良重组子增加了2.7倍,比出发菌株高出5倍多,实现了高效表达。 通过研究,本论文在四个方面取得了成果:(1)获得了β-葡萄糖苷酶的高产菌株,建立了产酶过程中pH调控和分批补料的方法与工艺。(2)酶的纯化及其性质的研究为获得更适合于植物纤维原料酶水解的β-葡萄糖苷酶或拓宽其新的应用领域打下了基础。(3)建立了超滤法、丙酮沉淀法、固定化酶法回收利用β-葡萄糖苷酶的方法及其工艺,为建立β-葡萄糖苷酶辅助降解纤维原料酶解液的新模式或新工艺提供了理论依据。(4)成功克隆出黑曲霉β-葡萄糖苷酶的基因,并在毕赤酵母中实现了高效表达,显示出了很好的工业化应用潜力。


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