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低聚糖和纤维类碳源对里氏木霉合成纤维素酶的诱导作用

张晓萍  
【摘要】: 本论文以里氏木霉(Trichoderma reesei)RUT C30为产酶菌种,研究了不同碳源诱导产纤维素酶的过程。首先研究了可溶性碳源纤维低聚糖和淀粉水解液。研究显示纤维低聚糖不能诱导纤维素酶,而以淀粉水解液为碳源,当浓度达到28.85 g/L时,在156 h达到最大滤纸酶活11.2 FPIU/ml,具有良好的诱导能力。采用HPAEC-PAD分析了淀粉水解液的组成,产酶过程中各组分的消耗及纤维素酶的合成,发现淀粉水解液主要由异麦芽糖、龙胆二糖和纤维二糖组成,有46.1 %的纤维素酶合成发生在淀粉水解液中龙胆二糖、纤维二糖和槐糖完全消耗后,证实异麦芽糖参与了纤维素酶的诱导。分析了淀粉水解液和异麦芽糖被胞外纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、T. reesei菌丝体和胞内酶水解的过程,发现龙胆二糖和纤维二糖很容易被降解,不能作为纤维素酶的诱导物,而异麦芽糖几乎不能被胞外酶水解,但在菌丝体和胞内酶的作用下转化为槐糖等二糖,从而实现纤维素酶的诱导。 通过对纸浆采用酸、碱处理后得到一系列不同结晶度和结构的纤维素用于产纤维素酶,发现滤纸酶活力随着结晶度的增加而提高。以10 g/L纤维素产酶,当碳源的结晶度为28.9 %时,滤纸酶活力仅为2.8 FPIU/ml,最大酶活6.3 FPIU/ml是在结晶度为63.1 %的碳源获得。纤维素的结构相对于结晶度对β-葡萄糖苷酶活力影响更大,当碳源的结构为纤维素I时,酶活力均在1.4 IU/ml以上,而当碳源的结构为纤维素II时则下降到0.6 IU/ml以下。 采用HPAEC-PAD详细研究了纸浆,Solka Floc、MCC和AHP2(酸水解纸浆)的产酶过程中培养基的变化和菌丝体胞内物质,发现其中含有微量的葡萄糖、木糖、纤维二糖、槐糖、异麦芽糖和麦芽糖等物质,在胞内,异麦芽糖是含量最高的二糖。分别以自产纤维素酶和菌丝体对四种固体碳源进行了酶解实验,发现以纤维素酶酶解时,产物以葡萄糖、木糖和纤维二糖为主,但仍有少量转糖苷产物槐糖、异麦芽糖和麦芽糖产生。以菌丝体酶解碳源时,水解产物以转糖苷产物为主,并随时间的增加而增加,在48 h转糖苷产物分别达到80.0、92.3、84.6和71.8 %,其中异麦芽糖分别占33.3、32.2、54.7和56.9 %。结果显示异麦芽糖作为纤维素降解的主产物,参与了固体碳源诱导纤维素酶的过程。从产酶的结果可以看出那些纤维素酶生产能力强的碳源能产生更多的异麦芽糖。 采用双向电泳比较了不同碳源诱导的纤维素酶酶系。以纤维素为碳源,酶系中可检测到150~170个蛋白质点,除了纤维素酶组分CBH I,CBH II,EG I,EG II外,还有Cel 74A, MAN,Axe1,BXL I,XYN I,XYN IV,Agl I,ABF等多种半纤维素酶组分,及非水解蛋白SWO,CIP I,CIP II的存在。但碱处理纸浆为碳源时,酶系中不含Axe1,EG IV和EG III,此外pI为7.5的EG III也几乎消失。以淀粉水解液为碳源诱导的酶,其电泳谱图中蛋白质点仅有110个,酶系中缺少pI为5.0的EG III, Agl I及CIP II等多个蛋白,但出现了在其它固体碳源中没有发现的内切葡聚糖酶EG IV。


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