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鸡CⅡ的分离提取、生物学特性分析及其口服耐受对类风湿性关节炎干预的研究

姜旭淦  
【摘要】:类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性滑膜炎症、关节软骨侵蚀为特征的自身免疫性疾病,发病机制未明。Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡcollagen, CⅡ)是软骨基质的主要有机成分,由3条相同的α1(Ⅱ)链组成。近年来研究表明,类风湿性关节炎的发病与CⅡ诱导的自身免疫应答有关,在10%-30%的RA患者血清和关节滑液可检测到抗天然和变性CⅡ抗体,用CⅡ免疫某些动物可诱导出实验性关节炎,口服CⅡ诱导免疫耐受对类风湿性关节炎有显著的疗效。但是研究结果差别很大,在抗CⅡ自身抗体的产生和诱导免疫耐受的机制方面研究进展缓慢,极大地限制了CⅡ的临床实际应用。主要影响因素包括:(1)CⅡ的来源和提取方法;(2)CⅡ抗体检测条件;(3)CⅡ的生物学特性、消化酶对其的作用;(4)口服CⅡ的剂量、剂型和机体胃肠道黏膜的免疫状态等。在本研究中,我们通过选择分离条件,建立了从鸡胸箭突软骨中提取和纯化CⅡ的可靠方法,对CⅡ的生物学特性进行了系统分析;优化实验条件,建立了血清抗CⅡ抗体的ELISA检测法,并探讨其在类风湿性关节炎的应用价值;体外研究各种消化酶对CⅡ的水解片段,体内经口服观察机体特异性IgG、IgA、IgM抗体的产生水平和对派氏集合淋巴结细胞因子表达的影响,探讨口服CⅡ诱导免疫耐受的可能性和对类风湿性关节炎干预的可能机制。 第一部分Ⅱ型胶原蛋白的提取和纯化 目的:优化实验条件,建立提取和纯化Ⅱ型胶原蛋白的可靠方法。 方法:选择鸡胸箭突软骨为提取原料,用盐酸胍去除蛋白多糖,对胃蛋白酶的消化方式、氯化钠盐析浓度、DEAE阴离子树脂种类进行研究,采用SDS-PAGE对CⅡ进行鉴定。 结果:鸡胸箭突前处理方便,其软骨匀浆液主要含有CⅡ在内的4种蛋白质。4 mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖;采用分步消化方式、控制反应温度在4℃、消化后的胶原蛋白溶液迅速调节到pH7.5等措施能获得满意的限制性酶解结果;氯化钠盐析浓度为2.4mol/L时最佳。SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的CⅡ与Sigma公司的产品一致,亚基分子量约为120kD。 结论:改进后的方法具有材料广泛、实验条件简便、结果可靠等优点,适用于科研、临床等各种规模CⅡ的提取。 第二部分Ⅱ型胶原蛋白的生物学特性研究 目的:研究CⅡ的物理化学特性、抗体产生规律和免疫反应性。 方法:用光谱法测定CⅡ吸收峰和等电点、HPLC法检测CⅡ氨基酸组成、乌氏黏度计测定不同条件下CⅡ溶液的增比黏度。SDS-PAGE法测定分子量,结合免疫印迹法分析CⅡ和热变性CⅡ(denatured typeⅡcollage, D-CⅡ)的免疫反应性。用CⅡ免疫新西兰白兔,每隔10天收集血清,以改良间接ELISA法检测抗CⅡ抗体效价。 结果:SDS-PAGE电泳显示CⅡ有α、β和γ三条区带,都能与抗CⅡ抗体发生特异性反应,α亚基分子量约120kD;D-CⅡ含有10多条免疫印迹反应呈阳性的片段。CⅡ溶液的最大吸收峰为230nm,等电点pH值约6.25。氨基酸组成中,甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量高,芳香族氨基酸低。CⅡ溶液的增比黏度随浓度的增加而增加,在25~45℃范围内随着温度的升高逐渐下降。Ⅱ型胶原蛋白免疫新西兰白兔后,经ELISA检测,在免疫的第10天抗体效价达1:3200,第20天升至1:204800;加强免疫后,第30天和第40天抗体效价分别达到1:409600和1:819200。 结论:Ⅱ型胶原蛋白具有独特的理化性质,因富含脯氨酸故具有较强的免疫原性,免疫新西兰白兔后获得高效价的CⅡ血清。 第三部分血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用 目的:建立血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的ELISA检测法,探讨其在类风湿性关节炎诊断和治疗方面的应用价值。 方法:以上述实验提取的鸡Ⅱ型胶原蛋白作为包被抗原,优化实验条件,建立抗Ⅱ型胶原蛋白抗体间接ELISA法。对289例RA病人和54例健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体进行检测。 结果:Ⅱ型胶原蛋白抗体ELISA检测法的条件为:先用0.05 mol/L醋酸将CⅡ配成0.5 g/L储存液,再用PH7.60.05 mol/L磷酸盐缓冲液将CⅡ配成20μg/ml的包被液,4℃12 h进行包被,继以10%羊血清、37℃2 h为封闭条件;用含10%羊血清的缓冲液分别将血清作1:50稀释、酶标抗体作1:2000稀释;采用双波长450nm/630 nm进行测定。采用建立的方法,发现RA患者和健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体阳性率分别为19.38%和1.85%,两组有明显的统计学差异(P0.01)。 结论:CⅡ可以作为血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体ELISA法的包被抗原;用含10%羊血清的缓冲液对酶标反应板进行封闭和对血清标本、酶标抗体进行稀释,可以有效地阻止非特异性吸附,提高结果的重复性和特异性。抗Ⅱ型胶原蛋白抗体可作为判断RA患者病情的一个辅助诊断指标。 第四部分消化酶对Ⅱ型胶原蛋白作用的体内外研究 目的:体外观察消化酶对天然Ⅱ型胶原蛋白(native typeⅡcollage,N-CⅡ)和变性Ⅱ型胶原蛋白(D-CⅡ)的酶解作用;小鼠和大鼠胃肠道给予CⅡ探讨口服Ⅱ型胶原蛋白对类风湿性关节炎可能的干预机制。 方法:在体外将胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶分别作用于N-CⅡ和D-CⅡ,采用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法分析酶解产物。将N-CⅡ和D-CⅡ注入鼠胃和十二指肠内,在不同时间收集胃和肠内容物,进行SDS-PAGE电泳分析。 结果:CⅡ在胃、肠道能处于溶解状态。在体外,N-CⅡ在胃蛋白酶和糜蛋白酶作用下电泳和免疫印迹图谱无变化,而被胰蛋白酶作用后出现10条免疫印迹为阳性的条带;D-CⅡ易被上述消化酶分解。N-CⅡ不被胃内环境水解,可被肠道消化酶缓慢降解;D-CⅡ可被胃、肠道消化酶迅速分解。 结论:N-CⅡ可被胰蛋白酶水解产生多条活性片段,但对胃内环境、胃蛋白酶和糜蛋白酶具有抵抗力;D-CⅡ易被胃、肠道消化酶水解。结果提示口服CⅡ诱导免疫耐受、治疗类风湿性关节炎可能与CⅡ特性和胰蛋白酶对其的作用有关。 第五部分口服Ⅱ型胶原蛋白对血清抗体和派氏集合淋巴结细胞因子表达的影响 目的:探讨口服Ⅱ型胶原蛋白对派[伊尔]氏集合淋巴结(PP结)的形态学、细胞因子表达水平和血清特异性IgG、IgA、IgM含量的影响。 方法:连续10d给小鼠口服不同剂量的CⅡ,第11天和第21天用佐剂或CⅡ进行免疫,分别于第11天、第21天和第31天采集血液和PP结。PP结经HE染色后,镜下观察其增生的情况。用荧光实时定量RT-PCR法,检测PP结中IL-17、TNF-α、IFN-γ和TGF-β1 mRNA的水平。采用ELISA法检测血清抗CⅡIgG、IgA、IgM的水平。 结果:口服CⅡ10d后,PP结增生活跃,高剂量组可见清晰的帽状结构;血清中出现IgA,未见IgG和IgM水平增加;IL-17、TNF-α、IFN-γmRNA的表达受到抑制。以CⅡ初次免疫后,实验组IgA、IgM、IL-17的水平均低于对照组(p0.05或p0.01),TGF-β1的水平显著增加(p0.05)。以CⅡ加强免疫后,高剂量组IgA的水平显著增加(p0.05),实验组IgM的水平仍受到抑制(p0.05或p0.01),TGF-β1的水平高于对照组(p0.05)。以佐剂免疫时PP结中细胞因子的表达与CⅡ免疫时相似,未见血清抗CⅡIgG、IgA、IgM水平的变化。 结论:口服CⅡ能使血清中产生特异性IgA,抑制PP结IL-17、TNF-α、IFN-γ的基因表达,对CⅡ免疫后IgA、IgM的产生和IL-17 mRNA的表达具有一定的抑制作用。血清特异性抗体的水平和细胞因子表达的变化的结果表明,口服CⅡ有助于诱导免疫耐受并干预类风湿性关节炎的发生发展,有着潜在的类风湿性关节炎防治作用。


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