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新型无机纳米载体的构建及其药物/基因的高效传递研究

曹霞  
【摘要】:纳米载体在药物/基因传递中具有特殊的价值和意义。纳米载体粒径大小在10~100nn,可将药物分子包裹其中或吸附在其表面,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进入细胞内,实现安全有效的靶向药物输送和基因治疗。无机纳米粒载体因具有生物安全、高效、价廉等优点,已成为近年来新型药物/基因传递系统研究的热点。本论文重点围绕新型无机纳米粒载体的构建及其在药物/基因传递中的应用开展研究,主要分为四个部分: 第一部分纳米载体在药物/基因传递中的应用研究进展 对纳米药物载体及基因载体的国内外研究现状进行了综述,主要内容包括:纳米载体的特点及制备新技术、纳米药物缓控释系统的优点、基因载体的分类与特点、非病毒纳米基因传递系统的优点、新型纳米载体在药物/基因传递系统中的应用进展、基于组织工程的三维支架以及软骨种子细胞的定向诱导分化研究进展等。文献综述为论文后续实验工作的开展奠定了基础。 第二部分新型多孔二氧化硅纳米粒在药物传递中的应用研究 以生物安全的硅胶为载体材料,运用纳米技术,自行研制出具有高效增溶、长效缓释作用的新型多孔二氧化硅纳米粒(Porous silica nanoparticles, PSNs)。分别选择水溶性药物水飞蓟宾葡甲铵(Silybin meglumine, SLBM和难溶性药物水飞蓟宾(Silybin, SLB)为模型药物,研究PSNs新载体在水溶性药物和难溶性药物72h高效长效制剂开发中的应用可能,为3天给药1次的高效长效新制剂开发提供技术支撑。 1.水溶性药物72h高效长效新制剂的研制:以水溶性药物水飞蓟宾葡甲铵)为模型药物,PSNs为载体,制备了水飞蓟宾葡甲铵72h高效长效制剂(3d-SLBM)。体外评价研究结果表明:3d-SLBM的主药含量为29.46 mg/50mg,载药量为58.91±0.39%,包封率为58.43±0.62%;体外释药特性研究结果显示,3d-SLBM中SLBM的释放适宜在低浓度的碳酸钠溶液中进行,72 h累积释放大于80%;体内药动学研究结果显示:比格犬口服3d-SLBM,高效液相法测定犬体内血药浓度,3d-SLBM的Tmax 24 h与参比制剂Tmax 0.5 h相比大大增加,3d-SLBM的MRT 38.89 h与参比制剂的MRT 7.31 h相比显著延长,显示出长效缓释特征;3d-SLBM中游离药物的相对生物利用度达到803.99%;体外溶出结果与体内吸收具有良好的相关性,体外溶出结果可以间接反映其体内质量;药效实验结果表明:3d-SLBM组小鼠血浆中AST(291.83±76.03 IU/L)和ALT(774.92±223.85 IU/L)值明显低于CCl4对照组(AST:901.00±174.32 IU/L,ALT:1997.58±335.08 IU/L),具有统计学意义(P0.01)。说明3d-SLBM的生物利用度高、保肝效果好。 2.难溶性药物72h高效长效新制剂的研制:以难溶性药物水飞蓟宾为模型药物,综合运用固体分散速释技术、亲水凝胶骨架缓释技术和PSNs长效缓释技术制备了水飞蓟宾72h高效长效制剂(3d-SLB)。体外评价研究结果表明:3d-SLB中SLB的释放适宜在低浓度的碳酸钠溶液中进行,72 h累积释放大于80%;体内药动学研究结果显示:比格犬口服3d-SLB,高效液相法测定犬体内血药浓度,3d-SLB的Tmax 24h与参比制剂Tmax 1h相比大大增加,3d-SLB的MRT 32.15 h与参比制剂的MRT 6.11 h相比显著延长,显示出长效缓释特征;3d-SLB中游离药物的相对生物利用度达到458.98%,体外溶出结果与体内吸收具有良好的相关性,体外溶出结果可以间接反映其体内质量;药效实验结果表明:3d-SLB小鼠血浆中AST(149.90±28.14 IU/L)和ALT(843.33±169.18 IU/L)值明显低于CCl4对照组(AST:901.00±174.32 IU/L,ALT:1997.58±335.08 IU/L),具有统计学意义(P0.01)。说明3d-SLB生物利用度高、保肝性能优越。 第三部分载基因纳米粒的制备及其在基因传递中的应用研究 选择生物安全的磷酸钙纳米粒(Calcium phosphate nanoparticles, CPNPs)和PSNs,制备载基因DNA-CPNPs和DNA-PSNs;通过对载基因纳米粒进行修饰,成功制备了多糖修饰的DNA-CPNPs和钙离子化DNA-PSNs;着重研究了DNA-CPNPs、多糖修饰的DNA-CPNPs、钙离子化DNA-PSNs 3 (?)中新型载基因纳米粒对干细胞的传递效果。 1.DNA-磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞的传递研究:用反相微乳法制备了DNA-CPNPs,对其进行表征,并将其应用于干细胞的转染。研究结果表明:DNA-CPNPs的粒径为20-50 nm;琼脂糖电泳结果表明:磷酸钙:质粒质量比为2:1时,CPNPs携带质粒量最大,可有效阻滞DNA的迁移;活细胞工作站测定结果显示:游离DNA因没有纳米粒载体的作用,细胞未显红色,说明游离DNA未进入细胞内,而DNA-CPNPs 2 h开始有少数细胞显红色,随着时间的推移,越来越多的外源基因进入细胞,说明纳米粒可有效携带基因进入细胞;激光共聚焦显微镜观察核转运结果显示:2 h未见细胞核内显红色,说明DNA-CPNPs此时尚未进入细胞核,4 h进核亦不明显,8 h有少量进核,18h可见细胞核内呈明显的红色,表明此时外源DNA在纳米粒作用下进核明显;活细胞工作站和共聚焦显微镜测定结果均显示纳米粒可被干细胞吞噬。MTT法测定细胞毒性,结果显示:DNA-CPNPs的毒性明显低于市售转染试剂Lipofectamine2000 (P0.01);ELISA测定结果表明,DNA-CPNPs在干细胞中的转染效果与转染试剂Lipofectamine2000相当(P0.05)。实验研究结果表明:DNA-CPNPs转染效率高、毒性低,可以作为一种生物安全的非病毒基因载体。 2.多糖修饰的DNA-磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞的传递研究:选择DNA-CPNPs,通过对载基因纳米粒进行修饰,成功制备了多糖修饰的DNA-CPNPs,初步研究了多糖修饰的DNA-CPNPs在干细胞中的转运情况。透射电镜测定结果表明:多糖修饰的DNA-CPNPs呈球型、粒径分布稳定、分散均一,粒径在50nm左右;ELISA测定结果表明:与市售脂质体lipofectamine2000相比,多糖修饰的DNA-CPNPs在干细胞中具有更高的转染效率。 3.钙离子化DNA-多孔二氧化硅纳米粒的制备及其性能评价:选择PSNs为载体,通过对其进行修饰,成功制备了钙离子化DNA-PSNs,初步研究了钙离子化DNA-PSNs在干细胞中的转运。琼脂糖电泳结果表明:钙离子化的PSNs能够与质粒DNA较好的结合,阻滞其电泳迁移,而未修饰的PSNs与DNA结合能力弱,不能有效阻滞DNA迁移;EDS能谱分析结果表明:钙离子有效结合到PSNs上;倒置荧光显微结果表明:与DNA-PSNs相比,钙离子化DNA-PSNs能够转染更多的细胞,说明钙离子化DNA-PSNs可以作为一种有效的非病毒基因载体。 第四部分三维纳米基因传递系统的构建及其在干细胞诱导分化中的应用研究 将细胞外基质修饰纳米粒技术与基于组织工程的三维支架技术相结合,构建非病毒三维纳米基因传递系统。以细胞外基质(ECM)成分为支架材料,制备嵌合有DNA-CPNPs的三维支架,成功构建了兼具高效、缓释特征的非病毒三维纳米基因传递系统(3 dimensional nanoparticles gene delivery system,3D-NGDS)。 1.三维纳米基因传递系统的构建及其性能评价:以细胞外基质黏附实验为基础,选择对干细胞黏附及增殖效果好的纤维粘结蛋白、胶原为支架材料,制备胶原/FN/壳聚糖三维支架;在此基础上,采用冷冻干燥法制备嵌合DNA—CPNPs的三维纳米基因传递系统(3D-NGDS),并观测其孔径、孔隙率、吸水率、保水率,结果表明:3D-NGDS中存在较大孔径(≥100μm)的孔道,吸水率和保水率与支架材料的配比有关。研究结果表明:3D-NGDS多孔、生物安全,适宜干细胞生长。 2.三维纳米基因传递系统的基因转运研究:以碘化丙啶标记基因,通过活细胞工作站观测,结合免疫组化的方法,对3D-NGDS中基因的细胞内转运进行了研究;运用Picogreen Dye法测定不同支架不同时间培养液中DNA的含量,绘制DNA累积释放曲线,结果显示3D-NGDS中DNA累积释放率3d达到33.4%,21d达到69.7%;而游离DNA-三维支架3d DNA累积释放率达到87.7%,3D-NGDS对DNA具有良好的缓释作用。ELISA法测定二维体系及3D-NGDS 3-15天细胞表达的TGF-β1浓度,结果表明:3D-NGDS在3-15天内,蛋白表达水平维持在10 ng/ml左右,其中第6天表达浓度达到12.6 ng/ml,显著高于二维转染体系(P0.01),达到了外加TGF-β1因子有效浓度,显示出明显的高效特征。通过观测干细胞在二维及3D-NGDS中转染15天的甲苯胺蓝(GAG)染色图及Ⅱ型胶原免疫组化染色图,结果表明:二维单层培养细胞的GAG染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阴性,干细胞在3D-NGDS中培养15天后,GAG染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性,说明种子细胞已成功分化成软骨细胞,分泌软骨细胞特征性的细胞外基质:Ⅱ型胶原和GAG。三维纳米基因传递系统作为一种新型的非病毒基因载体,可以实现外源基因在种子细胞中的高效持续表达,为后续组织工程和再生医学研究提供新技术、新思路。


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