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重组蛋白MAP30诱导EC-1.71和BGC-823细胞凋亡及其机制的初步研究

韩晓红  
【摘要】:目的: 江苏省是食管癌和胃癌高发区,目前治疗方法主要有手术切除、化疗和放疗,这些方法不仅副作用大,价格昂贵,而且易产生耐药,加之其作用的非特异性,在杀伤肿瘤细胞的同时也影响正常组织细胞的代谢,降低机体的免疫力,下调免疫监视功能。有鉴于我国传统中医中药扶正祛邪的理论,在上述常规或减量治疗的基础上辅以中医中药,既协助对肿瘤的杀伤作用,又从整体水平调节机体的免疫平衡状态,发挥祛邪扶正之功效。可见,开发一种治疗效果好,副作用小的抗瘤中药,挖掘我国传统医药宝库有着十分重要的意义。苦瓜不仅是民间喜爱的食物,而且资源丰富,价廉,毒性低,具有清热解毒、降低血糖、抗突变、抗病毒、抗HIV、抗肿瘤、抗菌及免疫调节等作用,若将苦瓜开发成安全有效的天然药物,其意义非常重大。从苦瓜中分离的生物活性物质中最引人注目的是一组核糖体失活蛋白(ribosome inhibiting protein, RIP),根据其肽链数目的不同分为Ⅰ型和Ⅱ型两种。Ⅰ型RIP具有抗肿瘤和抗病毒等生物学活性,其抗肿瘤功能的重要机制之一是诱导细胞凋亡。MAP30 (momordica anti-HIV protein of 30kDa)是一种Ⅰ型核糖体失活蛋白,由于MAP30不能进入正常细胞,故对正常细胞没有毒性作用。最近研究表明MAP30具有抗肿瘤活性,能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,但其凋亡机制尚未十分清楚。本文通过分子克隆技术克隆表达并纯化了苦瓜重组MAP30融合蛋白,探讨了其诱导人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823的凋亡作用及其凋亡机制。 方法: (1)应用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段,将其TA克隆和测序,并构建重组表达载体pET-28a-MAP30,转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,用NTA-Ni2+树脂分离纯化所表达的MAP30融合蛋白,纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定。 (2)重组MAP30融合蛋白分别与人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823共培养,通过细胞计数法、MTT实验、集落形成试验、裸鼠致瘤实验和小鼠转移瘤实验检测重组KAP30融合蛋白对人食管癌细胞EC-1.71增殖的抑制作用,通过细胞计数法、MTT实验和裸鼠致瘤实验检测重组MAP30融合蛋白对人胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用;运用光学显微镜、电子显微镜和荧光染色观察重组MAP30融合蛋白对人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823形态的影响;通过DNA琼脂糖凝胶电泳(DNA Ladder)和流式细胞术来分析重组MAP30融合蛋白诱导人食管癌细胞EC-1.71的凋亡作用,通过流式细胞术来分析重组MAP30融合蛋白诱导人胃癌细胞BGC-823的凋亡作用。 (3)通过JC-1荧光探针检测重组MAP30融合蛋白作用后人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823线粒体膜电位(△Ψm)的变化;通过ELISA法检测重组MAP30融合蛋白作用后人食管癌细胞EC-1.71培养上清液中Cytc和TNF-α的变化以及人胃癌细胞BGC-823培养上清液中Cytc的变化;通过免疫细胞化学法检测重组MAP30融合蛋白作用后人食管癌细胞EC-1.71中ERK1、PERK1, AKT/PAKT,NF-κB和c-jun的表达以及人胃癌细胞BGC-823中NF-κB的表达;通过荧光酶标仪检测重组MAP30融合蛋白作用后人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823的Caspase-12活性变化;通过RT-PCR检测重组MAP30融合蛋白作用后人胃癌细胞BGC-823 caspase-9和Apaf-1 mRNA的表达;通过分光光度法检测人胃癌细胞BGC-823的Caspase-3活性,初步探讨了重组MAP30融合蛋白诱导人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823凋亡的机制。 结果: (1)成功扩增出MAP30基因,长度为861bp,与GenBank中公布的DQ643967序列相比同源性为100%,与DQ643968和S79450序列相比同源性为99%;成功构建pET-28a-MAP30原核表达重组质粒,并获得了重组MAP30融合蛋白,大小约为30KDa,与预测一致。 (2)重组MAP30融合蛋白体内外均可以抑制人食管癌细胞EC-1.71增殖,其作用呈剂量-效应依赖关系,IC50为82.86μg/mL;重组MAP30融合蛋白作用于人食管癌细胞EC-1.7148小时和72小时后,光学显微镜下可见细胞变圆,固缩,体积缩小,细胞膜发泡,可见凋亡小体,细胞分散并有少量细胞浮起;电子显微镜下可见细胞固缩,体积缩小,细胞核片段化,核染色质聚集成块并靠近核膜,核膜扭曲,内质网高度膨胀、扩张;荧光染色结果显示重组MAP30融合蛋白在体外可诱导人食管癌细胞EC-1.71凋亡,但是不具有剂量-效应关系;流式细胞仪检测结果显示随着重组MAP30融合蛋白剂量的增加,G0/G1期细胞百分数增加,而S期细胞百分数减少;但DNA片段检测在琼脂糖凝胶电泳中未观察到典型的“阶梯状”图谱。 (3)重组MAP30融合蛋白体内外均可以抑制人胃癌细胞BGC-823增殖,其作用呈剂量-效应依赖关系,IC50为51.67μg/mL;重组MAP30融合蛋白作用于人胃癌细胞BGC-823后,光学显微镜下可见细胞变圆,固缩,体积缩小,细胞膜发泡,可见凋亡小体;电子显微镜下可见细胞表面微绒毛消失,细胞缩小,细胞核浓缩,染色质凝集,核膜褶皱,细胞质浓缩;荧光染色结果显示重组MAP30融合蛋白在体外可诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡;流式细胞仪检测结果显示随着重组MAP30融合蛋白剂量的增加,细胞的亚二倍体核峰逐渐升高。 (4)重组MAP30融合蛋白作用于人食管癌细胞EC-1.71后,细胞的△Ψm水平下降,细胞培养上清液中Cytc和TNF-α含量增加,胞质中ERK1、AKT表达增强而胞核中PERK1、PAKT表达降低(ERKl、AKT磷酸化减少),NF-κB活性降低,Caspase-12活性增强,但细胞核内原癌基因蛋白c-Jun表达未见明显变化。 (5)重组MAP30融合蛋白作用于人胃癌细胞BGC-823后,细胞的△Ψm水平下降,细胞培养上清液中Cytc含量增加,细胞的caspase-9和Apaf-1的mRNA表达增强,caspase-3活性增强,但细胞的caspase-12含量无明显变化,并且重组MAP30融合蛋白能活化人胃癌细胞BGC-823的核转录因子NF-κB. 结论: (1)本研究成功构建了pET-28a-MAP30表达载体,并获得了重组MAP30融合蛋白。 (2)重组MAP30融合蛋白体内外均具有抑制人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823增殖的作用,其作用呈剂量-效应依赖关系。 (3)重组MAP30融合蛋白可以诱导人食管癌细胞EC-1.71和人胃癌细胞BGC-823凋亡。 (4)重组MAP30融合蛋白诱导人食管癌细胞EC-1.71凋亡可能与内质网通路和NF-κB通路有关,但其具体机制尚有待进一步研究。 (5)重组MAP30融合蛋白可以活化人胃癌细胞BGC-823的核转录因子NF-κB,其诱导人胃癌细胞BGC-823凋亡的作用可能与线粒体途径有关,但其具体机制尚有待进一步研究。


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