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以菊芋为主要基质的乳酸菌培养与发酵活力研究

程新  
【摘要】:乳酸菌是制备酸奶、泡菜等发酵食品的重要菌种,采用纯菌种发酵可以获得更快的产酸速率,使发酵过程更加可控,是工业化生产的必然选择和发展方向。菊芋是一种品质优良的非粮作物,是制作泡菜的上乘原料。针对菊芋泡菜低温条件下无法自然发酵这一难题,本研究从江西传统低温发酵蔬菜制品中分离性能优良的低温发酵乳酸菌种,并应用于菊芋泡菜的低温发酵。同时为了满足大规模生产的需求,以廉价菊芋粉作为乳酸菌培养的主要营养基质,研究营养因子对乳酸菌增殖和发酵活力的影响,并利用酶学分析、蛋白组学分析、代谢组学分析等手段,深入研究了锰离子对乳酸菌发酵活力的影响机理,为廉价、高质量乳酸菌制备提供理论与实践依据。主要研究内容与结果如下: (1)利用MRS培养基和低温筛选流程,从江西特色腌制蔬菜-—捺菜中筛选得到17株乳酸菌,通过对其低温发酵活力、耐酸耐胆盐特性、降解亚硝酸盐等性能的测试,最终获得1株适合低温发酵菊芋泡菜的乳酸菌DY-2,经分子生物学鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。将筛选获得的DY-2菌株应用于菊芋泡菜发酵,结果表明该菌株具有较好的低温发酵性能,菊芋在10℃低温条件下发酵4天,发酵体系pH值可达4.0以下,发酵液活菌数高于7.0x107CFU/mL,发酵产品具有较好的风味与感官品质。 (2)采用高效液相色谱(HPLC)和气质联用仪(GC-MS)对不同温度下菊芋泡菜中风味物质进行测定。结果表明,在低温条件下乳酸菌的代谢特征会发生显著的变化,不仅合成酸类和挥发性风味物质的速度会发生改变,其发酵产物中不同有机酸和挥发性风味物质的含量也会产生差异,并最终影响发酵产品的口感。 (3)尝试将热风干燥菊芋干粉作为植物乳杆菌的主要培养基质。在10%菊芋干粉浸汁中添加葡萄糖8.0g/L、植物蛋白胨40.0g/L、硫酸锰0.45g/L后,植物乳杆菌DY-2在其中发酵12h-15h后最大活菌数可达3.3×109CFU/mL以上,略高于实验室常用的MRS培养基,同时菌体保持较高的发酵活力。 (4)在5-L发酵罐中进行乳酸菌发酵培养,研究提高菌体密度的控制策略。结果表明,控制pH可以大幅度提高乳酸菌的培养效果,发酵体系pH值控制在5.0左右效果最佳,植物乳杆菌DY-2发酵12小时后,最大菌体浓度可达9.6×109CFU/mL以上,比不调控pH时提高3倍左右;温度的改变仅仅影响乳酸菌的生长速度,对其最大活菌数并无太大影响,且较高的培养温度会使乳酸菌在发酵后期的衰亡速度加快;培养基初始营养物质浓度降低对乳酸菌的培养效果影响很大,而糖类的补充不仅会使乳酸菌的产酸速度加快,从而会促进菌体在发酵后期的衰亡,而且菌体的发酵活力也显著降低。 (5)研究了营养元素添加对乳酸菌增殖和发酵活力的影响。结果表明碳源和氮源的补充会显著增强乳酸菌的增殖效果,而锰离子的缺乏并不会对乳酸菌的增殖产生显著影响。但当缺锰培养基培养的乳酸菌用于食品发酵时,其产酸速率和生长速率都会大幅度降低,说明锰离子是确保乳酸菌保持高发酵活力的重要因子,锰离子缺乏会导致乳酸菌发酵活力显著降低。 (6)采用酶学分析技术研究锰离子缺乏对乳酸菌代谢中主要酶的影响。结果表明在缺少锰离子的情况下,乳酸菌胞内6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力并不会受到显著影响,但乳酸脱氢酶的活力会显著下降,而丙酮酸脱氢酶的活力则显著上升,说明锰离子可以影响乳酸菌胞内丙酮酸的代谢流向,从而调节代谢通路。 (7)采用基于GC-MS分析技术的代谢组学研究锰离子对植物乳杆菌胞内代谢物的影响。结果表明,锰离子添加对乳酸菌胞内糖及其衍生物、氨基酸、脂肪酸及其衍生物等物质有显著影响,其中以氨基酸的影响最为显著。在缺乏锰离子的情况下,乳酸菌发酵至6-9h时,胞内氨基酸含量大幅度上升,但在12h时又显著低于对照组。 (8)采用基于iTRAQ分析技术的蛋白质组学研究锰离子对植物乳杆菌代谢的影响。结果显示,锰离子缺乏发酵6小时后共鉴定出56种差异蛋白,其中31种蛋白表达上调,25种表达下调;发酵9小时后,共鉴定出78种差异蛋白,其中40种蛋白表达上调,38种蛋白表达下调,共有16种蛋白在两个时间点均表现出显著性差异。由于锰离子缺乏,乳酸菌胞内多种核糖体结构蛋白的表达量总体下调,但与DNA修复和应激反应相关的蛋白则显著上升,其中UspA家族蛋白是上升最为显著的蛋白之一,说明锰离子缺乏会使菌体处于非正常的应激状态。同时锰离子对丙酮酸代谢、氨基酸代谢等多条代谢通路都有极为显著的影响,说明锰离子是维持乳酸菌正常代谢水平必须的重要因子。


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