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基于计算机模拟与超声辅助酶法制备高生物利用度玉米蛋白的研究

金建  
【摘要】:玉米蛋白是湿法生产玉米淀粉的副产物,约含70%的蛋白质,其独特的理化组成以及必需氨基酸的缺乏严重限制了其在食品工业中的应用。本文旨在通过酶法水解以提高玉米蛋白的生物利用度,通过玉米蛋白的超声波预处理提高其酶解效率和产物得率。本文开发了基于生物信息学平台的蛋白质酶切过程计算机模拟软件,利用该软件完成蛋白酶的自动筛选;根据筛酶结果,研究了不同酶解程度(水解度)下玉米蛋白生物利用度的变化规律及其分子机制;针对玉米蛋白存在因富含疏水性氨基酸而导致的溶解性低、结构致密这一分子结构缺陷,研究了双频功率超声波(聚能式、发散式)预处理对玉米蛋白酶解特性的影响;通过紫外光谱、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱、圆二色谱、扫描电镜和原子力显微镜等多尺度分析方法和测试手段研究了双频功率超声波促进玉米蛋白酶解的作用机理;根据超声的作用机制和玉米蛋白的分子结构特征,采用米氏方程、一级动力学模型、阿伦尼乌斯方程以及过渡态理论研究了发散式双频扫频超声预处理对玉米蛋白酶解反应动、热力学参数的影响。本文得出以下主要研究结论:(1)开发出了可以满足蛋白质酶切基本过程模拟与结果分析的计算机软件,该软件能对蛋白质进行单(双)酶定向靶位酶切,能以指定的蛋白水解度为特征指标完成蛋白酶的自动筛选,并可以对酶切产物的分子量分布及其端点疏水性氨基酸的含量进行统计分析。(2)酶解反应显著提高了玉米蛋白的生物利用度,且提高幅度与蛋白水解度直接相关。体外模拟消化表明,水解度通过影响酶解液的多肽分子量分布和氨基酸组成来影响其生物利用度。酶解液中分子量大小为200-500 Da组分的含量几乎不受胃蛋白酶、胰蛋白酶的影响。随水解度的增大,游离疏水性氨基酸尤其Ala、Met、Ile、Val和Phe的含量增加,Thr和Leu含量减小;酶解液中的总氨基酸、疏水性氨基酸尤其是Leu、Pro和Ala含量随水解度的增大而增加。氨基酸消化率表明,酶解液中疏水性氨基酸Met、Ile、Pro、Ala的消化率显著下降,Thr的消化率显著上升,水解度对亲水性、疏水性氨基酸的平均消化率无显著性影响。(3)针对蛋白质的超声预处理,以水解度和蛋白转化率为指标,分别优化得出了聚能式和发散式两种功率超声波的最佳工作模式及其工作参数。与无超声的常规酶解相比,玉米蛋白经聚能顺序双频超声预处理后,其水解度和蛋白转化率分别提高了45.3%和59.3%;经发散双频扫频超声预处理后,其水解度和蛋白转化率分别提高了38.8%和54.7%。玉米蛋白经超声尤其是聚能顺序双频超声预处理后,其酶解液的分子量分布范围更窄,主要集中在200-1000 Da之间。(4)紫外光谱、荧光发射/激发光谱、表面疏水性结果表明,超声预处理能暴露出埋藏在分子内部的疏水性内核、使得蛋白质分子舒展,有利于酶解反应的进行。傅里叶变换红外光谱和圆二色谱分析结果表明,经超声预处理后,蛋白各二级结构(a-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲)的相对含量发生了变化,且超声对玉米蛋白中的谷蛋白的作用强于对醇溶蛋白的作用。扫描电镜结果表明,尽管顺序双频处理后的醇溶蛋白出现了一定的聚集,但超声预处理能破坏蛋白的微观结构、减小颗粒的尺寸,增大酶与蛋白质的接触机会。亚显微结构及纳米机械力学特性分析表明,超声预处理能减小谷蛋白的颗粒高度和表面粗糙度,能减小醇溶蛋白的杨氏模量和刚度,增加蛋白的粘附力。发散式双频扫频超声适合于疏水性较强的蛋白预处理,而聚能式顺序双频超声适合于疏水性较弱的蛋白预处理。(5)动力学研究表明,玉米蛋白经双频扫频超声预处理后,其酶解反应的表观常数(KM值)降低了26.1%、表观崩解常数(kA值)增加了7.3%,说明超声处理后的玉米蛋白与酶的亲和力和结合频率得到提高;热力学分析表明,玉米蛋白经双频扫频超声预处理后,在293、303、313和323 K的反应温度下的酶解反应速率常数(k)分别提高了84.8%、41.9%、28.9%和18.8%,酶解反应的活化能(Ea)、活化焓(ΔH)、活化熵(△S)分别降低了23.0%、24.3%和25.3%,意味着酶解反应更容易进行。


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