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基于超声预处理的谷朊蛋白ACE抑制肽制备及其过程原位监测技术研究

张艳艳  
【摘要】:小麦谷朊蛋白是一种非常有潜力的制备生物活性肽的植物蛋白源,其酶解产物可通过显著地抑制血管紧张素转换酶(ACE)的活性,而达到降低血压的目的。但由于谷朊蛋白遇水易交联形成粘弹性强的网络状结构且分散性极差导致其酶解效率低。超声波预处理底物蛋白可以通过改变蛋白的结构而提高蛋白的酶解效率,但是超声波预处理过程中底物蛋白结构的动态变化以及与酶解效率的关系还尚不清楚。超声波预处理过程和蛋白酶解反应过程还无法实现原位在线的监测和终点的快速判断。本文旨在通过多模式超声波预处理提高谷朊蛋白的酶解效率,建立超声波预处理过程中蛋白结构变化与酶解产物活性的定量分析模型;通过原位实时光谱技术,在超声波预处理环节监测谷朊蛋白受超声波影响巯基(-SH)和二硫键(S-S)含量的变化规律,并在酶解反应环节监测谷朊蛋白的水解度(DH)、多肽浓度、ACE抑制率等主要指标的变化规律。主要研究结果如下:(1)以谷朊蛋白的DH和酶解产物的ACE抑制率为指标,研究了多模式超声波预处理对谷朊蛋白酶解特性的影响,得出超声波最佳工作模式和预处理参数。在改善谷朊蛋白酶解效果方面,同步双频工作模式优于单频工作模式,而交替双频工作模式又优于同步双频工作模式。在最优的交替双频工作模式下,超声波最佳预处理参数为:频率组合20-35 kHz、交替时间5 s、超声功率密度200 W/L、物料初始温度30℃、料液浓度30 g/L、超声处理时间10 min。经交替双频超声预处理后,谷朊蛋白的DH为12.51%、ACE抑制率为80.03%、IC50值为0.696mg/mL、蛋白转化率为75.4%。与未经超声波预处理的对比,交替双频超声预处理使得谷朊蛋白的DH提高了2.37%、ACE抑制率提高了19.30%、IC50值下降了6.5%。通过研究交替双频超声波预处理对酶解过程的影响发现,超声波预处理可以使得酶解产物的ACE抑制率提前10 min达到其最大值。产生这种现象的原因主要为超声波预处理在酶解反应的前期提高了分子量在200~1000 Da多肽的含量。(2)利用原子力显微镜、红外光谱等技术手段,研究了超声波频率、功率密度和预处理时间对谷朊蛋白表面微观结构(微观形貌和表面粗糙度)、纳米力学特性(杨氏模量和黏附力)、分子结构(巯基含量-SH、二硫键含量S-S、表面疏水性H0和二级结构)的影响。结果发现:超声波破坏了谷朊蛋白的网络结构,适当的超声波预处理使得蛋白分子分布更加均匀,表面粗糙度变大;过长的预处理时间(10min)或者过大的超声波预处理功率密度(200w/l)又使得蛋白分子重新聚集折叠,表面粗糙度也有所下降,不利于蛋白分子的酶解;超声波预处理使得蛋白表面的纳米力学特性重新分布,蛋白表面的平均杨氏模量和平均黏附力下降;超声波预处理均使得谷朊蛋白的-sh含量、s-s含量、h0、二级结构发生变化,主要体现为-sh、s-s、h0的提高和α-螺旋含量减少。(3)通过皮尔森相关性分析、主成分分析、逐步多元线性回归分析等方法,研究了超声预处理过程中底物蛋白结构表征与酶解产物ace抑制率的关系。相关性分析显示,谷朊蛋白的-sh含量、表面粗糙度(ra,rq)、h0与蛋白酶解产物的ace抑制率有显著(p0.05)的正相关关系,-螺旋、平均杨氏模量、黏附力与蛋白酶解产物的ace抑制率在有显著(p0.05)的负相关关系。主成分分析选取了3个主成分表示原始各结构含量在样品中的79.628%的信息。第一主成分为蛋白的-sh含量、平均黏附力、ra、rq、h0;第二主成分主要为β-折叠和无规则卷曲;第三主成分主要为蛋白质的s-s含量。α-螺旋与蛋白的杨氏模量和黏附力有很高的相关程度。逐步回归分析方程所建立的方程为ace抑制率=86.361+6.841(-sh)-0.687(α-螺旋)-0.162(s-s),r2为0.9380此方程可以用来反映谷朊蛋白酶解底物结构表征与产物ace抑制率之间的定量关系。(4)建立了谷朊蛋白超声波预处理过程的原位实时光谱监测系统和光谱采集方法,可以稳定地采集到超声波预处理过程中谷朊蛋白的原位近红外光谱信息。对超声波预处理过程中的原位光谱进行了标准正态变换(snv)、多元散射校正(msc)、一阶导数(1stderivative)和二阶导数(2ndderivative)四种方法的预处理。权衡考虑校正模型和预测模型的相关系数和均方根误差大小,筛选出最优子区间。在最优光谱区间的基础上研究原位实时光谱反应系统结合线性模型联合区间最小二乘法(si-pls)和误差反向传播神经网络(bp-ann)建立超声波预处理过程中-sh、s-s含量的校正模型。结果显示,最佳的光谱预处理方法为snv。-sh含量的最佳联合区间为869~947、1207~1284、1458~1536和2205~2274nm。s-s的最佳区间为933~992、1388~1446、2091~2148和2217~2274nm。在最优区间的基础上非线性模型si-bp-ann的预测效果优于线性模型si-pls。最终,对于-sh含量,预测集的相关系数rp为0.9113,均方根误差rmsep为0.38μmol/g。对于S-S含量,预测集的Rp为0.7523,均方根误差RMSEP为6.56μmol/g。(5)建立了谷朊蛋白酶解过程的原位实时光谱监测系统和光谱采集方法。对酶解液的近红外光谱进行了SNV、MSC、1st Derivative和2nd Derivative四种方法的预处理。利用联合区间最小二乘法Si-PLS建立模型,以模型的相关系数和均方根误差作为衡量指标,筛选出了建模的最佳光谱区间。结果显示,SNV预处理后光谱的建模效果最好。DH的最佳联合区间为1129.1~1200.4、1439.2~1509.9、1976.3~2046.2和2128.6~2198.2 nm;多肽浓度的最佳联合区间为1586.9~1644.6、1766.1~1817.1、2166.6~2217.2和2337.2~2387.7 nm;ACE抑制率的最佳联合区间为1168.0~1252.1、1798.0~1880.9、1887.2~1969.9和2337.2~2412.9 nm。利用最佳光谱区间建立了谷朊蛋白DH、酶解液多肽浓度和ACE抑制率的Si-PLS回归模型。DH预测模型的Rp为0.9570,RMSEP为1.73%;多肽浓度预测模型的Rp为0.9840,RMSEP为0.79 mg/mL;ACE抑制率预测模型的Rp为0.9536,RMSEP为5.12%。以上研究结果表明:交替双频超声波预处理可以显著地提高谷朊蛋白酶解产物的ACE抑制率。酶解产物ACE抑制率的提高主要是由于超声波预处理提高了-SH含量、降低了谷朊蛋白的-螺旋相对百分含量、平均杨氏模量和平均黏附力,其中-SH含量的提高对ACE抑制率的贡献最大。近红外原位实时监测系统结合Si-BP-ANN模型可以很好地适用于超声波预处理过程中谷朊蛋白-SH、S-S含量的原位实时监测;近红外原位实时监测系统结合Si-PLS建模方法可以同时监测谷朊蛋白酶解过程中的DH、多肽浓度和ACE抑制率的动态变化。研究成果为开发拥有自主知识产权的超声波预处理制备ACE抑制肽的原位实时监测装备提供理论基础和方法借鉴。


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