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盐矿嗜盐古菌多样性及其产胞外蛋白酶初步研究

袁盼盼  
【摘要】:盐矿是一类极端高盐环境,蕴藏着丰富多样的嗜盐古菌类群,是开展嗜盐古菌理论与应用研究的珍贵资源。云南盐矿作为我国重要的陆地高盐环境,特殊的地质构造形成了盐矿集中分布的特性,一平浪盐矿就是其中规模较大的盐矿之一。本文从云南一平浪盐矿采集样品,培养、分离、纯化嗜盐古菌测定嗜盐古菌菌株的16S rRNA基因序列,揭示可培养嗜盐古菌多样性;对部分疑似新物种的菌株,进行多相分类学研究以确定它们的分类地位;筛选出产胞外蛋白酶能力较强的菌株,对其所产粗酶的酶学特性进行初步研究。基于16S rRNA基因序列分析与系统发育分析结果表明:云南一平浪盐矿的59株嗜盐古菌分属14个属的20个分类单元,其优势类群为Natronococcus类群、Natrinema类群和Halococcus类群。多相分类学研究表明,菌株YPL13代表一个新种,菌株YPL18代表一个新属。筛选云南一平浪盐矿分离的59株嗜盐古菌,得到12株产胞外蛋白酶菌株,其中YPL20、YPL23、YPL24、YPL26产胞外蛋白酶水平最高,对其进行16S rRNA基因和rpoB′基因序列分析,结果表明均为Halococcus salifodinae菌株,其中YPL20和YPL23为相同菌株,YPL24和YPL26为相同菌株。因此,选择H.salifodinae YPL20和H.salifodinae YPL26作为进一步研究对象。嗜盐古菌胞外蛋白酶的表达与培养基营养丰富情况尚未有过报道,本实验使用分别添加牛奶或明胶的营养缺乏的NOM、营养适中的HM、营养丰富的CM平板培养基培养H.salifodinae YPL20和H.salifodinae YPL26菌株并观察胞外蛋白酶产生水平,结果表明H.salifodinae YPL20和H.salifodinae YPL26菌株胞外蛋白酶的产生受寡营养条件的诱导,在NOM培养基中产胞外蛋白酶水平最高。使用NOM培养基培养H.salifodinae YPL20和H.salifodinae YPL26菌株并制备粗酶液进行酶学性质表征,结果表明H.salifodinae YPL20和H.salifodinae YPL26分泌的胞外蛋白酶具有耐高温耐盐碱以及良好的热稳定性和酸碱稳定性的特征,Mn2+对蛋白酶的酶活性表现出显著的激活作用,而Cu2+、Zn2+能够抑制蛋白酶的活性。H.salifodinae YPL20的胞外蛋白酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为9.0,最适NaCl浓度为0 M;H.salifodinae YPL26的胞外蛋白酶最适反应温度为75℃,最适反应pH为8.0-9.0,最适NaCl浓度为2.5 M。有趣的是,对氯汞苯甲酸PCMB和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF均能够抑制H.salifodinae YPL20和H.salifodinae YPL26的胞外蛋白酶活性,暗示着H.salifodinae YPL20和H.salifodinae YPL26的胞外蛋白酶粗酶液中可能存在着活性位点为半胱氨酸和丝氨酸的蛋白酶。因此,在未来的研究中,将对H.salifodinae YPL20和H.salifodinae YPL26的胞外蛋白酶进行纯化确定蛋白酶种类并对相应的基因进行克隆,以发现新型嗜盐古菌蛋白酶并揭示蛋白酶分子和基因的种内多样性。


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