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致病性小肠结肠炎耶尔森菌外膜蛋白A功能初步研究

李楚楚  
【摘要】:目的:小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)是一种革兰阴性无芽孢杆菌,属于肠杆菌科耶尔森菌属,是该菌属的三大致病菌之一,可通过水和食品传播、以胃肠道症状为主的疾病。小肠结肠炎耶尔森菌外膜蛋白A(outer membrane protein,Omp A)高度保守,具有较强的种间交叉免疫原性,是包括鼠疫耶尔森菌在内的致病性耶尔森菌疫苗研究的潜在候选蛋白。本研究对致病性小肠结肠炎耶尔森菌OmpA在该菌致病性、抗生素抵抗能力、生存能力以及免疫保护中的作用进行了探索,为进一步的基础研究和疫苗研制提供了理论依据和技术基础。方法:1.以体外培养的人喉癌上皮细胞HEp-2为模型,通过细胞粘附侵袭实验和细胞毒性实验研究致病性小肠结肠炎耶尔森菌105.5R(r)、105.5R(r)Δomp A、105.5R(r)Δail,以及非致病菌株Y40在细胞粘附侵袭和毒性上的差异。2.使用微量肉汤稀释法检测105.5R(r)、105.5R(r)Δomp A和105.5R(r)Δail对于β-内酰胺类抗生素、呋喃妥英以及多粘菌素的抵抗能力。使用AmpCβ-内酰胺酶过表达突变株YEΔamp D123为对照,先后使用冷光报告质粒pLUXamp C和头孢硝噻吩显色法检测105.5R(r)、105.5R(r)Δomp A和105.5R(r)Δail的amp C表达水平以及AmpCβ-内酰胺酶的水解活性。3.比较105.5R(r)、105.5R(r)Δomp A和105.5R(r)Δail在高氧化压、铁缺乏等不利条件下的生长速率,评估各基因缺失对于细菌细胞膜功能和生存能力的影响。4.使用高致病小肠结肠炎耶尔森菌YE92010对OmpA免疫组和对照组大鼠进行攻毒,观察攻毒后各组大鼠的体征、排菌情况以及组织病理学改变,探究Omp A对于大鼠的免疫保护作用。结果:1.各菌株对于HEp-2细胞的粘附能力检测结果表明:105.5R(r)ΔompA与105.5R(r)Δail的细胞粘附侵袭能力均低于野生株,但仍高于非致病菌株Y40。细胞毒性检测结果:(35)omp A菌株和(35)ail菌株对于HEp-2细胞的毒性大幅下降,与非致病菌株Y40相比已无统计学差异。2.105.5R(r)ΔompA的ampC表达水平和总β-内酰胺酶活性实验结果与野生株相比均没有差异,两者在高氧化压、铁缺乏环境下的生长速率亦处于同一水平。然而,药敏试验结果表明105.5R(r)Δomp A对于大多数青霉素类抗生素如氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦以及头孢菌素类抗生素如头孢唑林、头孢他啶的抗生素抵抗能力均显著下降。3.在动物实验中,Omp A表现出良好的免疫保护功能。尽管免疫组与对照组大鼠在攻毒后均出现厌食、被毛杂乱、粪便呈松软非颗粒状等症状,但Omp A免疫组大鼠的肝、脾、肠组织病变程度、组织变性及坏死灶情况,以及粪便排菌时间明显低于对照组大鼠。结论:1.OmpA在致病性小肠结肠炎耶尔森菌细胞粘附侵袭过程以及细胞毒性中发挥重要作用。2.105.5R(r)Δomp A在高氧化压、铁缺乏环境下的生存能力与野生株相同,表明OmpA的缺失并没有明显改变细菌的膜通透性。然而,105.5R(r)ΔompA对于多种β-内酰胺类抗生素的抵抗能力明显减弱,并且这一现象的出现并非由于β-内酰胺酶的表达量的降低所引起,该机制还有待于进一步的研究。3.Omp A具有优良的免疫保护作用,免疫组大鼠可有效抵抗高致病菌株的肠道定植能力,组织病理学改变程度较轻,体现出良好的致病性耶尔森菌疫苗研制价值。


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