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人源DNA聚合酶δ小亚基p50泛素化修饰分析

刘凤玉  
【摘要】:人源DNA聚合酶δ(Polδ)是由p125、p68、p50及p12四个亚基组成的异源四聚体,它不仅是染色体基因组复制最主要的DNA聚合酶,还参与了细胞内多种DNA损伤的修复过程。DNA聚合酶δ的高保真性及持续合成能力使得DNA能够准确、连续的复制,即:催化大亚基p125具有3’-5’核酸外切酶活性,能够保证DNA复制时掺入的碱基是正确配对的,即使发生小概率的错配,其错配的碱基也会被外切酶活性所切除,从而保证DNA复制的准确。除了在多种DNA损伤修复机制中发挥独有的作用外,Polδ自身还是一个DNA损伤响应的靶标,前期研究发现,在UV或烷化剂等损伤试剂诱导下产生的DNA损伤过程中,p12亚基通过UbcH5c/RNF8(E2/E3)介导的泛素-蛋白酶体途径降解,使得Polδ转变为对DNA损伤有更强识别和纠错能力的Polδ3形式以应对;我们前期的研究还发现,在相同的E2/E3调控系统下,p50亚基有被单泛素化修饰的迹象,但尚未获得最终的确认。鉴于p50亚基单泛素化修饰可能在跨损伤合成(修复)途径中介导Polδ与TLS聚合酶交换过程扮演重要角色,本论文研究首先通过建立的体外泛素化分析系统,以UbcH5c/RNF8及Rad6/Rad18这两种E2/E3调控系统对p50的单泛素化修饰进行了验证,同时对Polδ其他亚基的泛素化修饰情况也进行了分析,结果表明,两种E2/E3调控系统均能介导p50发生单泛素化修饰,且以UbcH5c/RNF8介导的p50单泛素化修饰程度更强,但这两种调控系统均不能介导p125和p68发生泛素化反应;UbcH5c/RNF8能够介导p12发生多泛素化反应,而Rad6/Rad18疑似能够介导p12的单泛素化反应。然后,利用UV射线处理培养的HeLa细胞,观察在DNA损伤情况下细胞内p50的泛素化修饰情况,发现在UV诱导产生DNA损伤的情况下,p50确实能够发生单泛素化修饰。最后,通过亚细胞定位实验,观察到Polδ能够与RNF8及TLS聚合酶Polε共定位到经UV射线处理所产生的损伤点(域),表明细胞内一旦发生DNA损伤,在p12经泛素-蛋白酶体途径降解的同时,Polδ以缺失了p12的三聚体形式Polδ3与RNF8及Polε(当然也包括其他多种修复相关的蛋白,例如PCNA等)被快速共募集到损伤点(域)参与跨损伤修复,此时,RNF8可能介导p50亚基发生单泛素化修饰。根据以上实验结果,我们假设了一种在TLS途径中基于p50单泛素化修饰的聚合酶交换机制。本论文研究为深入理解跨损伤合成(修复)途径中聚合酶Polδ与TLS聚合酶的交换机制,也为今后以Polδ作为小分子抑制剂的潜在的新靶标,设计新的肿瘤诊断、治疗手段来抗击人类疾病如癌症疾病等提供理论参考。


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