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产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌耐药及分子流行病学研究

卢洁  
【摘要】:目的:产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌感染因预防及治疗难度大,已成为院内感染患者死亡的独立危险因素。本研究对江苏大学附属人民医院过去两年半时间内收集的肺炎克雷伯菌耐药菌株进行表型研究及分子分型,探讨产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的耐药机制及临床现状,追踪传染源及可能的传播途径,从而指导院内感染的防控。方法:1.菌株的培养与保存:收集江苏大学附属人民医院2015年7月至2018年1月间对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌株,在血平板上分离纯化后取单个菌落,用磁珠冻存管-80℃冻存。2.药物敏感性试验:采用VITEK 2 COMPACT全自动微生物鉴定系统进行菌种鉴定并测定抗生素最小抑菌浓度。3.全院耐药数据的采集与分析:分析对比该院同时段内肺炎克雷伯菌检出率及对亚胺培南等抗生素耐药率变化。4.改良碳青霉烯类水解试验:将美洛培南药敏纸片与样本菌悬液共孵育后,取纸片进行敏感菌株药敏试验,根据抑菌圈直径判断样本株的碳青霉烯酶表型。5.多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST):分别提取产碳青霉烯酶表型阳性菌株的DNA,进行PCR试验扩增7对管家基因,将测序结果上传相关网站获得对应菌株的ST分型。6.脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE):挑取样本新鲜单个菌落进行制胶、酶切、脉冲场凝胶电泳,通过软件分析条带相似度,进行分群,判断菌株同源性。7.产碳青霉烯酶基因检测:分别提取产碳青霉烯酶表型阳性菌株的DNA,进行PCR试验扩增KPC-2、NDM、VIM、OXA-48、GEM及IMP耐药基因。8.全基因组测序(Whole genome sequencing,WGS):根据待测菌株同源性及ST结果,筛选待测菌株进行全基因组测序,根据菌株单个核苷酸多态性分析耐药菌株的遗传进化关系,分析其在院内的传播路径。结果:1.经Vitek 2 compact全自动微生物鉴定系统鉴定,共留取对亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌株90株。2.在去除重复患者菌株数据后,Whonet软件分析结果示2016年-2018年间,耐碳青霉烯类菌株检出率逐年稍呈下降趋势,未检出替加环素耐药菌株,对1~4代头孢菌素类抗生素耐药率均为100%。而对氨基糖苷类的耐药率相对较低,在68%-85%之间。3.碳青霉烯类水解试验显示所有待测菌株均能通过合成碳青霉烯酶获得抗性。4.样本菌株绝大多数为ST11型肺炎克雷伯菌,未检出新ST型别。5.通过脉冲场凝胶电泳分型,90株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌可分为12个克隆株,其中82株之间同源性超过80%,有69株属于同一克隆株。6.通过PCR扩增及序列测定,所有耐药菌株均携带kpc-2基因,未检出NDM、VIM、GES、OXA-48及IMP酶。7.结合MLST及PFGE分型,筛选出8株高度同源的耐药株进行全基因组测序,结果显示8株耐药菌的纯合SNP数量约924至2002个不等,根据遗传进化距离可大致分为3簇。In Del突变位点数相近,平均为336个,近一半分布于外显子区域。结论:1.该院内肺炎克雷伯菌对亚胺培南在内的碳青霉烯类药物耐药率远低于国内平均水平,且2016-2018年呈下降趋势,耐药控制情况良好。但对常用抗生素如头孢菌素类等耐药性仍有上升趋势。对碳青霉烯类抗生素耐药性主要来自于合成KPC酶,对替加环素敏感性为100%。2.该院内耐药株主要存在于ICU科室,主要为ST11型,PFGE呈高度同源性,结合8株耐药菌全基因组测序结果,考虑该院内除单个克隆株引起的院内流行以外,可能存在单克隆耐药株长期广泛定植,在较长时间内发生不同方向进化突变形成的不同菌株并引起院内传播,需进一步加强对耐药株流行的监测及院内感染防控。


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